[發明專利]一種檢測幽門螺桿菌耐藥基因的方法和檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410410194.2
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104164509A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 季旻珺;焦健華;普漢明;駱曉鳳;屈保進;錢明芳;楊丙雅;侯敏
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種檢測幽門螺桿菌的耐藥基因的方法，其特征在于：以待檢樣本基因組DNA為模板，用巢氏PCR外道引物進行PCR反應；再以巢式PCR的外道產物作為模板，用等位基因特異性引物作為內道引物進行PCR；內道PCR擴增后的產物在含溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，并在紫外線透射儀下檢查有無特異擴增條帶；在相應的位置處，若出現亮光條帶，則為陽性；若無條帶，則為陰性；其中巢氏PCR特異性外道引物，其序列如SEQ?ID?NO.1和2所示；內道引物序列如SEQ?ID?NO.3-9所示。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：PCR反應體系由10倍濃縮的PCR擴增反應液、Taq?DNA聚合酶、dNTP、引物、雙蒸水、待檢樣本基因組DNA、陰性對照標本和DNA抽提試劑盒組成。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的Taq?DNA聚合酶，活性單位為8U/μL。

4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于10倍濃縮的PCR擴增反應液為10x?Takara?Taq?TMBuffer?(Mg2⁺?plus)。

5.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于.所述的陰性樣本為快速尿素酶和¹³C呼氣試驗陰性，且細菌培養陰性的標本。

6.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的DNA抽提試劑盒組成為：3SColumn、2.0ml?coll?tube、Digestion?Buffer、Solution?B、Wash?Solution、Proteinase?k、TE?pH8.0。

7.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于PCR反應DNA的擴增條件如下：

1）反應體系：10×PCR緩沖液?5μl，10μM?dNTP?1.0μl，外道上游引物?1.0μl，外道下游引物1.0μl，Taq?DNA聚合酶?1μl，雙蒸水?40μl，唾液的基因組DNA?1μl，共50μl；

2）反應條件：預變性94℃?5?min；變性94℃?30s，退火55℃?30?s，延伸72℃?30s，35個循環；延伸72℃?5?min；4℃保存。

8.一種檢測幽門螺桿菌的耐藥基因的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括：一套巢式PCR特異性外道引物和6套等位基因特異性的內道引物，反應體系由10倍濃縮的PCR擴增反應液、Taq?DNA聚合酶、dNTP、內道引物和外道引物、雙蒸水、待檢樣本基因組DNA、陰性對照標本和DNA抽提試劑盒組成；

所述的一套巢式PCR特異性外道引物和6套等位基因特異性的內道引物如下：

1)?巢氏PCR外道引物，其序列如SEQ?ID?NO.1和2所示；

2)?巢氏PCR內道引物；其序列如SEQ?ID?NO.3-9所示。?