[發明專利]高通量STR序列核心重復數檢測方法

有效

• 申請號: 201410410187.2
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104152568A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 李俊吉;陸祖宏;涂景
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

A．將一對引物雜交到待測STR序列上，其中下游引物帶熒光標記；

B．重復交替地加入核苷酸單體組合，利用具有5’→3’外切酶活性的DNA聚合酶合成待測STR序列的互補鏈，每次加入核苷酸單體組合完成聚合反應后進行清洗，檢測熒光強度；

C．分析熒光信號的變化及信號變化發生的輪次，判斷STR序列的雜合情況并計算出核心重復數。

2.根據權利要求1所述的高效快捷的高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于：待測的STR序列簇固定于固相載體表面，其中所述固相載體表面包括測序流道或生物芯片的基片，以及連接在檢測基片上的媒介物的表面。

3.根據權利要求1所述的高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于步驟A之前還包括步驟：

A0.?對需要檢測的STR序列進行多重擴增，將待測STR序列直接或是通過媒介物擴增并連接到檢測基片表面。

4.根據權利要求2所述的高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于，所述的媒介物包括磁珠、微珠、微柱、微粒及微槽中的至少一個。

5.根據權利要求3所述的高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于，將海量樣本的多個STR序列通過間隔區域編碼或者插入測序標簽的方法，實現高通量地并行檢測。

6.根據權利要求1所述的高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于，步驟A中所述的一對引物分別位于STR序列核心區域的上游和下游，將檢測區域限定在STR核心區域附近，減少反應和檢測的輪次。

7.根據權利要求1所述的高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于，步驟A中所述的下游引物上修飾的熒光標記位于下游引物5’端附近的堿基上。

8.根據權利要求1所述的高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于，步驟B中所述的核苷酸單體組合為常用脫氧核糖核苷三磷酸中的一種或幾種。

9.一種高通量STR序列核心重復數檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(?1?)?樣本基因座STR序列的特異性擴增

選取相應數量的STR序列，作為檢測對象；通過多重PCR技術，將上述STR序列從人類DNA樣本的相應基因座上擴增出來；

選取完待檢STR序列后，根據STR序列中核心重復單元的序列信息來設計聚合時的核苷酸單體組合以及設計多組STR序列同時檢測的分組檢測方案，同時設計每種STR序列相應的上下游檢測引物并合成；

（2）檢測基片上STR序列的固定及文庫制備

檢測基片上的每一個反應位點上僅有唯一樣本的同一種STR單鏈序列拷貝；

上述STR單鏈序列拷貝可以直接固定于基片的固相載體表面，或者通過微媒介物間接地先將單鏈序列拷貝固定在媒介物的表面，再將媒介物固定于檢測基片的表面；

（3）STR序列核心重復數的檢測實驗

檢測反應進行前，讀取芯片上每個反應位點上的STR序列所屬的樣本信息以及基因座信息；

加入混合后的上下游檢測引物進行雜交，雜交完成后清洗并檢測熒光；

不斷重復進行加入核苷酸單體組合聚合的操作，并在每次聚合完全后清洗及檢測熒光，直至整張反應基片上所有反應位點的熒光降低到下限閾值以下后結束檢測；

（4）熒光信號分析

根據檢測芯片上的每個反應位點在不同輪次下的熒光信號強度，找到熒光信號強度發生衰減的反應輪次，根據該輪次及核苷酸單體組合方式推導出該位點上STR序列的核心重復數；

對熒光信號衰減率進行分析，判斷該位點的STR序列是否為雜合并根據二次熒光衰減得到另一條等位STR序列的核心重復數；

最終，通過對檢測芯片上海量位點的檢測結果進行統計學分析，得到每個樣本的每條STR序列的核心重復數及其純合比率。