[發明專利]一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法

有效

• 申請號: 201410409089.7
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104152565A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 王慧中;馮尚國;何仁鋒
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

技術領域

本發明屬于利用分子生物學方法鑒別硬葉兜蘭的技術領域，涉及一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法。

背景技術

硬葉兜蘭（Paphiopedilum?micranthum）是蘭科（Orchidaceae）兜蘭屬（Paphiopedilum）的植物，主要分布于我國云南、廣西、貴州等省區和越南北部。硬葉兜蘭因花奇特，花姿優美具有較高的觀賞價值，因而有“玉女蘭”之稱，被譽為世界最美的花朵之一。由于具有非常高的觀賞價值和經濟價值，人為過度采收和生境破壞嚴重，硬葉兜蘭野生種群數量急劇下降，分布范圍逐步縮小，野生資源處于極度瀕危狀態，被《瀕危野生動植物物種國際貿易公約》列為一級保護植物。因此，為了有效保護和尋找新的硬葉兜蘭群體，建立有效的鑒別硬葉兜蘭的方法是十分重要的。

傳統的形態學研究方法不能從本質上準確反映物種的遺傳變異與材料間的遺傳關系，單獨利用傳統的分類方法難以對種質資源的系統分類做出準確評價。隨著生命科學的不斷發展，分子標記鑒定技術應運而生，應用DNA?分子標記技術對植物進行鑒定取得了快速發展。DNA?分子標記技術彌補和克服了傳統鑒別方法的一些缺陷和難題。本實驗采用目標起始密碼子多態（start?codon?targeted?Polymorphism,?SCoT）分子標記方法，對硬葉兜蘭及其他一些兜蘭種類的遺傳多樣性進行研究，獲得了兜蘭SCoT指紋圖譜，從中篩選出硬葉兜蘭特異性條帶，通過克隆、測序等，設計了特異性探針，應用于硬葉兜蘭的鑒定，為有效的鑒別和保護硬葉兜蘭資源提供有效的分子技術依據。

發明內容

本發明的第一個目的是針對現有技術的缺陷，提供了一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列。

本發明用于鑒別硬葉兜蘭的特征性核苷酸序列來源于SCoT通用引物2（5’-CAACAATGGCTACCACCC-3’）擴增所得的硬葉兜蘭特異性核苷酸序列，具體序列為：

CAACAATGGCTACCACCCCTTAGCCTAAGGAGCTCTAAAGCTAGGGGAGGCTCCAGACTAGCGTTCCCCACGGTCGTATCACCGTGGAGACCGCCGGAGCCTCCCGGAAATGAAACCGAAAGAAAGAGCAGCCGGTGGTGGAGATAGAGGCTTACCCATGGTCCGTCAGTCAGATAAGAAGGTCCCTCGAGCTTCCTGGAGATGAGACGGAGCTAACGGCACCGGCCGGTGGTTGCAAGGTGGCCGGAGTTGACGTAGTCGACGGTGGTCAGTAACTTGTAAAGAGAGATTTCGGTATCATCGGGTATCCGTTTTTCACGATTTTTGATTCTATGTCCTCTTGAGGGGAAGGAGAATAACTTCCTAGGAGGAAGGTTGAGCTAAGGAGGGCTCTATGGATGACTTTGGAGGCTATCAATAGGGATTTTTTTTTGAGCTCGGAGAAGGATGGTAGCAGCGGATTTAGAGGGGCCTAGCAGGGCGCTCGGGTGGACGTTCCTCACAAATTTTGGCTCTATATTCTACTGAAGGGAAGGATAACAACTTATTAGAAGGAAGGTTGAGCTAATTAGGGCTCTATGGAGGACTTTGGAGGCTATCAATATAGGGATTCCTTGAGCTCAAAGGAGGGTGGTAGCCATTGTTG，如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明的第二個目的是提供基于上述鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列設計的用于鑒別硬葉兜蘭的核苷酸分子探針（YYF/YYR），該核酸分子探針序列如下：

上游引物YYF：5’-GAAATGAAACCGAAAGAAAG-3’，如SEQ?ID?NO.2所示；

下游引物YYR：5’-AATGGCTACCACCCTCCT-3’，如SEQ?ID?NO.3所示。

上述核苷酸分子探針（YYF/YYR），具有極高的專一性，僅與硬葉兜蘭發生反應，而不與其他兜蘭種類反應。利用該探針通過常規PCR擴增可以快速的對硬葉兜蘭進行鑒別。

本發明的第三個目的是提供上述鑒別硬葉兜蘭的分子探針的方法。

本發明采用上述核酸分子探針（YYF/YYR）作為特異性擴增引物，以硬葉兜蘭基因組DNA為模板，經PCR擴增，電泳檢測，獲得清晰的硬葉兜蘭特異性條帶，實現對硬葉兜蘭的鑒別。

本發明具有的有益效果：

1)?????樣品用量少，只需少量樣品就可以完成整個操作；