[發明專利]來源于嗜熱踝節菌的脂肪酶突變體及應用

有效

• 申請號: 201410409072.1
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104293744B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發明（設計）人: 鄭裕國;鄭仁朝;黎小軍;吳欣瑋;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術領域

本發明涉及脂肪酶編碼基因的克隆和利用基因突變技術制備脂肪酶突變體的方法，所獲得的突變體及其在普瑞巴林手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制備中的應用。

(二)背景技術

脂肪酶(lipase，EC?3.1.1.3)，系統名稱為三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerol?acylhydrolase)，是一類既能催化酯水解，又具有催化酯合成、轉酯化、氨解、醇解等反應的酶，在食品、洗滌、飼料、有機合成和生物能源等領域應用廣泛(Curr.Opin.Biotech.2002,13:390-397)。脂肪酶催化的反應除具有選擇性高、副反應少，產物光學純度高等特點外，還具有催化反應條件溫和、綠色環保等優勢。這使得脂肪酶在光學純化合物特別是手性藥物的制備中具有獨特的優勢，已成為制備光學純手性藥物的重要技術手段(Coord.Chem.Rev.2008,252:659-701.)。

普瑞巴林(Pregabalin)是一種新型γ-氨基丁酸(GABA)受體激動劑，能有效阻斷電壓依賴性鈣通道，減少神經遞質的釋放，具有良好的抗焦慮和神經痛治療效果(Angew.Chem.Int.Edit.2008,47:3500-3504)。由于療效顯著和適應癥的擴大，普瑞巴林的銷售額逐年遞增，2013年達到45.95億美元，列全球最暢銷藥物榜第13位，市場潛力巨大。2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)被脂肪酶/酯酶選擇性水解，其產物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制備普瑞巴林的重要手性中間體。該中間體經脫羧、堿性水解、氫化即得到普瑞巴林(Org.Process?Res.Dev.2008,12:392-398)。但目前只有來源于Novozymes公司的即商品化Thermomyces?lanuginosus脂肪酶能滿足工業化生產的需要。因此，開發能夠高效拆分CNDE的新催化劑具有重要意義。

熱穩定酶一般具有較強的溶劑穩定性，具有很好的生物技術和工業應用潛力(Environ.Technol.2010,31:1159-1167)。近年來，從嗜熱菌中獲得熱穩定酶已成為學術和工業界的研究熱點。嗜熱踝節菌(Talaromyces?thermophilus)是一類分布廣泛，生長溫度上限較高的嗜熱真菌，已成為具有工業應用價值熱穩定酶的重要來源。

隨著蛋白質工程技術和分子生物學的發展，運用分子改造的手段對酶分子進行改造已成為當前酶工程領域研究的熱點。到目前為止，這項技術已被成功用于改造各種各樣的酶，取得了令人矚目的進展(Curr.Opin.Struct.Biol.2011,21:473-480)。分子改造廣泛應用于脂肪酶催化活力、底物特異性、熱穩定性和對映體選擇性等性質的改造。

(三)發明內容

本發明目的在于通過定點飽和突變技術對嗜熱踝節菌的脂肪酶進行改造，提供脂肪酶突變體，其對2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的水解活力明顯提高，從而有利于該脂肪酶在普瑞巴林中間體制備中的應用。本發明的另一目的還在于提供含有編碼本發明所述的脂肪酶突變體的氨基酸序列。本發明的再一目的在于將本發明的突變體應用于選擇性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)制備普瑞巴林關鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。

本發明采用的技術方案是：