[發(fā)明專利]一種檢測禽流感病毒及其H3、N2亞型的引物及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410408502.8
• 申請(qǐng)日: 2014-08-19
• 公開（公告）號(hào): CN105368981A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芝勛;劉婷婷;羅思思;謝麗基;李孟;謝志勤;鄧顯文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測禽流感病毒及其H3、N2亞型的引物及其應(yīng)用，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

禽流感(Avianinfluenza,AI)是危害禽類養(yǎng)殖的一類重要傳染病，其病原體 AIV為單股負(fù)鏈的RNA病毒，分8個(gè)節(jié)段，分別編碼HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1 和PB2蛋白。在AIV8個(gè)基因片段中，M基因是最保守的基因片段，所有亞型AIV的 PCR檢測均選擇M基因作為靶基因。HA、NA是變異最大的兩個(gè)基因節(jié)段，兩者之間存 在的某種平衡對(duì)病毒的致病性有很大關(guān)系。根據(jù)HA、NA基因抗原性差異，AIV可進(jìn)一 步分為不同的亞型，目前已鑒別出18種HA(H1-H18)亞型和11種NA(N1-N11)亞型。 H3亞型AIV屬于低致病性AIV，其在低致病性AIV中占有較重要地位。研究表明，H3 亞型AIV在家禽中分離率較高，且在不同家禽中分布的季節(jié)性與我國人群中流感病毒 流行的季節(jié)性比較一致，這就為兩種宿主的流感病毒在豬這個(gè)“混合器”中發(fā)生基因 重排提供了條件。1968年暴發(fā)的香港流感病毒A/HongKong/68(H3N2)經(jīng)研究推測就是 由H3亞型AIV與H2N2亞型人流感病毒在宿主豬體內(nèi)發(fā)生基因重排而產(chǎn)生的。此外， N2亞型AIV是感染家禽(H9N2)并能致病的常見NA亞型，其可與大多數(shù)HA亞型AIV 組合形成不同血清型的AIV。因此，建立一種簡便、快速檢測AIV且能同時(shí)鑒別H3N2 亞型AIV的方法對(duì)我國養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生都有重要意義。

長期以來，針對(duì)AIV的檢測主要依靠傳統(tǒng)的病原分離鑒定與血清學(xué)試驗(yàn)，這些方 法耗時(shí)較長，給診斷帶來了一定的局限性。隨著分子生物學(xué)和生物試劑的不斷發(fā)展， PCR檢測方法已成為病毒檢測的重要部分。而多重RT-PCR以其同一反應(yīng)中可同時(shí)擴(kuò)增 出多個(gè)核苷酸片段的優(yōu)勢(shì)已應(yīng)用于多項(xiàng)病毒和基因的同時(shí)檢測。而目前專門針對(duì)H3N2 亞型AIV的PCR檢測方法未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測禽流感病毒及其H3、N2亞型的引物及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供一組引物，由如下(1)-(6)所示的DNA分子組成：

(1)SEQIDNo.1所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.3所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.4所示的DNA分子；

(5)SEQIDNo.5所示的DNA分子；

(6)SEQIDNo.6所示的DNA分子。

一種鑒定或輔助鑒定待測樣品中禽流感病毒及待測樣品中H3亞型和/或N2亞型 禽流感病毒的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒包含上述引物。

一種鑒定或輔助鑒定待測樣品中禽流感病毒及待測樣品中H3亞型和/或N2亞型 禽流感病毒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟：以待測樣品的cDNA為模 板，以上述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大 小為518bp的條帶，則待測樣品候選為含有禽流感病毒的樣品；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同 時(shí)含有大小分別為518bp和271bp的條帶，則待測樣品候選為含有H3亞型禽流感病 毒的樣品；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)含有大小分別為518bp和418bp的條帶，則待測 樣品候選為含有N2亞型禽流感病毒的樣品；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)含有大小分別為 518bp、418bp和271bp的條帶，則待測樣品候選為含有H3N2亞型禽流感病毒的樣 品；

所述大小為518bp的條帶是以SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的DNA分子為 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的；

所述大小為418bp的條帶是以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的DNA分子為 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的；

所述大小為271bp的條帶是以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的DNA分子為引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的。