[發明專利]一種能誘導豬體較早產生干擾素和中和抗體且具有廣譜免疫原性的PRRSV減毒株及其疫苗

有效

• 申請號: 201410407284.6
• 申請日: 2014-08-18
• 公開（公告）號: CN104388399B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 張澍;馬忠仁;馮若飛;呂宏亮
• 申請（專利權）人: 張澍;呂宏亮
• 主分類號: C12N7/08
• 分類號: C12N7/08;A61K35/765;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

技術領域

本發明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒減毒株及其疫苗，特別涉及一種能誘導豬體較早產生干擾素和中和抗體且具有廣譜免疫原性的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒減毒株以及由該減毒株或其傳代株制備得到的疫苗。本發明屬于醫藥生物技術領域。?

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)，屬于套式病毒目的動脈炎病毒科動脈炎病毒屬的成員，是引起豬繁殖與呼吸綜合癥的病原，可致妊娠母豬晚期流產、早產和產死胎，仔豬與育肥豬呼吸道疾病。?

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的基因組為單鏈正向RNA，其基因組長度為15kb左右，具有5’端帽子和3’端Poly(A)結構，已經發現有9個開放閱讀框(ORF1-9)。ORFs-1編碼負責病毒復制轉錄的酶，ORFs2-4分別編碼病毒粒子相關蛋白GP2、GP2b、GP3以及GP4，ORFs5-7分別編碼主要結構蛋白：糖基化囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)，囊膜蛋白(E)又稱GP5蛋白。目前PRRSV有2個主要基因型，歐洲型(1型)PRRSV和美洲型(2型)PRRSV，基因同源性55-70％，基因1型PRRSV病毒至少有3個遺傳譜系，基因2型PRRSV病毒至少有9個不同遺傳譜系。?

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒能夠引起母豬嚴重的生殖疾病，如死胎、畸形仔豬和二次感染的呼吸道疾病，在美國每年造成約5億美元的損失，在中國每年造成約200億人民幣的損失。目前已有減毒活疫苗和滅活疫苗用于豬豬繁殖與呼吸綜合癥的預防和控制。?

分子流行病學調研發現國內目前流行2和1基因型多種遺傳譜系的豬高致病性繁殖與呼吸綜合病毒。基因型、抗原性的多樣、不斷變異新變種的出現流行，且有疫苗株和野毒株重配、疫苗免疫豬體分離到變異株、以及減毒活疫苗免疫保護低下的現象。?

豬繁殖與呼吸綜合癥病毒逃逸機體免疫和病毒多樣性導致了目前國內外上市的減毒活疫苗和滅活疫苗的效果不甚理想，特別對異源基因型毒株感染免疫效果不佳。采用逆向分子遺傳學研制的試驗性的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗、減毒活疫苗、重組載體表達PRRSV蛋白疫苗、DNA疫苗、植物生產的亞單位疫苗都在不同試驗動物上嘗試，但由于病毒本身基因和抗原的多樣性、以及對其致病性和免疫性的了解甚少成為這些試驗性疫苗發展的主要挑戰。隨著抗PRRSV免疫和PRRSV逆向分子遺傳學的研究深入，合理設計研發具有廣譜免疫原性的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗成為疫苗研究的主要方向。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的減毒株，該毒株可較早激活豬體干擾素免疫防御系統，使得豬體較早產生I類干擾素，同時較早產生中和抗體和細胞免疫，同時激發對同源型和異源型的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的保護性免疫，以此病毒作為抗原注射機體，和現行的減毒活疫苗相比較，具有更安全、更穩定、免疫保護水平高、免疫譜廣、免疫持久等優點。?

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：?

豬繁殖與呼吸綜合征病毒強毒株(HP-PRRSV-LZ)的分離：從我國河北省保定暴發豬高熱綜合癥某豬場的病豬，將所采集的病料研磨、離心、過濾、取濾液凍存待用。用原代豬肺泡巨噬細胞擴增毒株傳4代后，用PRRSV的N、GP5引物進行RT-PCR擴增；用PRRSVCH-1a株的N、GP5蛋白特異性單抗通過間接免疫熒光方法進行鑒定，試驗證明該分離毒株為PRRS病毒，命名為HP-PRRSV–LZ-F4株；通過對HP-PRRSV–LZ-F4株的毒力的測定發現該株病毒對仔豬具有較強的致死性，PCR擴增結果為陽性。HP-PRRSV–LZ-F4株與PRRSV?N、GP5蛋白特異性單克隆抗體呈陽性反應，而與豬瘟病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒、豬乙腦病毒、豬戊肝病毒、豬胃腸炎病毒以及豬流行性腹瀉病毒的特異性單抗無交叉反應，采用RT-PCR技術對分離的HP-PRRSV–LZ-F4株的ORF7和ORF5基因進行進行了擴增，分別擴增出2個目的基因片段，在此基礎上對分離到的HP-PRRSV–LZ-F4株做了PRRSVNsp2和GP5的序列進行分析證明HP-PRRSV–LZ-F4株屬于美洲型(基因2型)，與已分離鑒定VR-2332具有較高的同源性。?