[發明專利]miRNA捕獲探針及其修飾電極與捕獲探針互補鏈及其修飾碳納米管?金磁納米粒復合物

有效

• 申請號: 201410406476.5
• 申請日: 2014-08-18
• 公開（公告）號: CN104152449B
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 項貴明;蒲曉允;張立群;蔣棟能;劉飛;劉暢;劉琳琳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于生物、材料和電化學檢測技術領域，涉及一種捕獲探針及其修飾電極，與捕獲探針互補鏈及其修飾的碳納米管-金磁納米粒復合物，還涉及用上述修飾電極和修飾的碳納米管-金磁納米粒復合物檢測生物活性小分子的方法。

背景技術

微小RNA(miRNA)是一類長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，能夠與靶基因3′非翻譯區結合在轉錄后水平負調控基因的表達。miRNA與人類疾病的發生、發展密切相關，且血液、尿液中的miRNA穩定性強、重復性好，因此可作為多種疾病尤其是腫瘤診斷的非創傷性生物標志物。

目前用于miRNA檢測的方法主要有Northern印跡、基因芯片和實時定量PCR(qRT-PCR)等。Northern印跡是首先被用于半定量檢測miRNA的實驗技術，至今仍被視為是檢測miRNA的金標準，由于其存在要求的樣本量大、靈敏度低、操作耗時且不適用于高通量檢測等缺點，通常用于miRNA檢測結果的驗證。基因芯片技術是當前廣泛用于檢測miRNA水平的高通量技術，該技術可一次性對大量樣本進行持續、快速、有效的檢測，但同樣存在檢測所需樣本量較大、耗費較高、不同實驗室之間結果可重復性差等諸多不足，一般多用于miRNA的初篩。qRT-PCR是生物醫學領域中較常用的miRNA檢測方法，系通過反應體系中熒光強度的變化對目標miRNA片段的擴增進行實時檢測，具有敏感性高、準確度高、方法簡單等優點，但對引物設計及實驗操作要求較高。因此，急需建立一種操作簡便、具有較高特異性和敏感性的檢測miRNA的新方法。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種miRNA捕獲探針及其修飾電極，與miRNA捕獲探針互補鏈及其修飾的碳納米管-金磁納米粒復合物，并基于上述修飾電極和修飾的碳納米管-金磁納米粒復合物建立一種檢測miRNA的新方法，可以實現對miRNA的快速、靈敏、特異和穩定檢測。

經研究，本發明提供如下技術方案：

1.miRNA捕獲探針，為單鏈DNA，從5’端至3’端依次含有與miRNA部分互補片段、核酸內切酶酶切位點以及與輔助探針部分互補片段，其3’末端還修飾有巰基；所述輔助探針為單鏈DNA，從5’端至3’端依次含有與捕獲探針部分互補片段以及與miRNA部分互補片段；所述miRNA捕獲探針中含有的與miRNA部分互補片段和所述輔助探針中含有的與miRNA部分互補片段不重疊。

進一步，所述miRNA捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述輔助探針的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

更進一步，所述miRNA捕獲探針為5′-CCACTTCAGTTAT-CCTCAGCGTGGAAAA-(CH₂)₆-SH-3′；所述輔助探針為5′-CCACGCTGAGGAAATCACAGTACTGTA-3′；

2.miRNA捕獲探針修飾電極，由以下方法制得：將經打磨、拋光、洗滌、干燥處理的金電極表面用miRNA捕獲探針修飾后，再用己烷巰醇封閉非特異性吸附位點，即得miRNA捕獲探針修飾電極。

進一步，所述miRNA捕獲探針修飾電極由以下方法制得：用潤濕的麂皮打磨金電極，然后依次用加有0.3μm和0.05μm Al₂O₃粉末的麂皮對電極進行拋光打磨，每次打磨后將電極用水洗凈，再依次用乙醇和水超聲洗滌，處理后的金電極干燥備用；然后在處理后的金電極表面滴加2μM的miRNA捕獲探針溶液，修飾過夜，用水清洗電極，再在電極表面滴加1mM的己烷巰醇溶液，孵育40分鐘封閉非特異性吸附位點，用水清洗電極，即得miRNA捕獲探針修飾電極。

3.miRNA捕獲探針互補鏈，所述互補鏈與miRNA捕獲探針中核酸內切酶剪切點下游序列互補，其3’末端還修飾有氨基。

進一步，所述miRNA捕獲探針互補鏈的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

更進一步，所述miRNA捕獲探針互補鏈為5′-TTTTCCACGCTGA-(CH₂)₆-NH₂-3′。