[發(fā)明專利]基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人副流感病毒快速檢測(cè)方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410406305.2
• 申請(qǐng)日: 2014-08-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105277714B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡征;楊波;董俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 董俊
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531;G01N33/533
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所42001
• 代理人: 余曉雪,王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人副流感病毒抗原的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，以及該檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。

背景技術(shù)

人副流感病毒(humanparainfluenzavirus，HPIV)是兒童急性呼吸道感染的重要病原體，主要經(jīng)飛沫傳染，亦可通過(guò)眼、口或鼻的粘膜接觸進(jìn)行傳播，發(fā)病率以嬰幼兒最高。人副流感病毒感染呈全球性分布，是常見(jiàn)的社區(qū)獲得性呼吸道感染的病原，人副流感病毒感染在小兒兒童急性呼吸道感染的發(fā)生率高達(dá)30-40％，其是導(dǎo)致小兒下呼吸道嚴(yán)重感染的、僅次于呼吸道合胞病毒的病原體。該病原體首先發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)50年代末，原名仙臺(tái)病毒，最初從日本仙臺(tái)市一例死于肺炎的患兒肺液中分離出來(lái)。根據(jù)遺傳學(xué)和血清學(xué)可分為4型，而1-3型在臨床中最為常見(jiàn),每種亞型主要的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征相似，但流行病學(xué)和所引發(fā)疾病的臨床特征有差異。副流感病毒1，2型所導(dǎo)致的相關(guān)疾病主要有義膜性喉炎、上呼吸道和下呼吸道感染；3型主要導(dǎo)致細(xì)支氣管炎及肺炎；4型在臨床上不多見(jiàn)，一般僅導(dǎo)致輕微感染。

臨床病人由于不同的呼吸道病原體(如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病癥狀可以十分相似，這導(dǎo)致了人副流感病毒的流行診斷比較困難，確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷。快速有效的診斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明確的診斷，便于實(shí)施針對(duì)性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。

盡管人副流感病毒在全球范圍內(nèi)傳播，嬰幼兒的感染尤其普遍，但可用于實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的種類極少。目前，人副流感病毒的檢測(cè)主要有以下幾種方法：

一、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、病毒分離

實(shí)驗(yàn)室診斷人副流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)是分離人副流感病毒毒株。采用鼻咽分泌物作為病毒分離的標(biāo)本，可以用LCC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)的方法分離病毒。但是該法有嚴(yán)重的缺陷，因?yàn)樗M(fèi)時(shí)費(fèi)力，通常需要一周才能得到最終結(jié)果，這樣在臨床方面對(duì)病人的治療就有一定的局限性。

2、血清學(xué)檢測(cè)

即采用酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗(yàn)等，檢測(cè)被檢者血清中人副流感病毒抗體水平，可間接提示人副流感病毒感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診斷，它需要同時(shí)檢測(cè)患者急性期和恢復(fù)期的雙份血清，如果恢復(fù)期中抗人副流感病毒抗體效價(jià)比急性期高4倍或4倍以上才有診斷意義。另外，抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存在人副流感病毒特異性抗體的差異，并且，據(jù)報(bào)道患兒IgM的檢出率大約只有50％，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測(cè)質(zhì)量受到一定限制。

二、快速診斷

直接檢查人副流感病毒蛋白抗原和病毒核酸可達(dá)到快速診斷的目的，目前主要有免疫熒光法、免疫酶法和PCR法等。免疫熒光法和免疫酶法均不能進(jìn)行一步檢測(cè)，均存在操作步驟復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(2h以上)，成本較高等缺點(diǎn)。PCR方法快速、靈敏、特異，是目前研究人副流感病毒感染的重要手段，但由于PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，在我國(guó)還不能作為常用的臨床診斷方法。因此，建立具備超高靈敏度的人副流感病毒特異性抗原快速診斷法十分必要。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)背景技術(shù)中存在的這些技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的能簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的檢測(cè)人副流感病毒抗原的檢測(cè)方法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人副流感病毒抗原的方法，其特征在于：所述該方法包括以下步驟：

1)兔抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗體的制備；

2)鼠抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗體的制備；

3)將步驟1)制備的兔抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗體分別與納米磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，分別制備抗I、II及III型人副流感病毒免疫納米磁珠，將上述三種免疫納米磁珠等量混合即制得抗人副流感病毒免疫納米磁珠；

4)將步驟2)制備的鼠抗I、II及III型人副流感病毒HN蛋白多克隆抗體分別與納米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，分別制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗I、II及III型人副流感病毒納米探針，將上述三種納米探針等量混合即制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人副流感病毒納米探針；