[發(fā)明專利]用于生物防控的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列及其載體和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410406303.3
• 申請日: 2014-08-18
• 公開（公告）號: CN104178490B
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余懋群;鄭明輝;李林;徐德林;龍海;潘志芬;鄧光兵
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院成都生物研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N15/113
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種用于生物防控的禾谷孢囊線蟲RNAi位點序列及其載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)

禾谷孢囊線蟲又稱燕麥孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲，對小麥、大麥、黑麥、燕麥及多種禾本科牧草具有嚴(yán)重危害性，是世界上廣泛存在的病原線蟲，尤其對小麥的生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。我國自1987年在湖北天門縣發(fā)現(xiàn)該病害以來，迄今已在華北、西北、華中以及華東等13個省區(qū)市發(fā)現(xiàn)有分布，且有逐漸蔓延之勢。目前的主要防治方法包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)農(nóng)藥防治和生物防治。長期以來我國農(nóng)民主要采取輪作、灌溉、增施有機廄肥、深翻和日曬土壤、種植誘捕植物和調(diào)節(jié)播期等農(nóng)業(yè)技術(shù)措施防治線蟲,但是日常種植的作物基本上都是禾谷孢囊線蟲的寄主,因而防治效果并不顯著。化學(xué)農(nóng)藥防控線蟲是有效的方法之一，但是它對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品造成的污染使得該方法缺陷凸顯。而生物防治目前報道最多的是食線蟲真菌和線蟲天敵細(xì)菌,但因其效果不明顯,商品化困難,至今尚沒有一種生防制劑被廣泛推廣。因此,尋找安全而又行之有效的線蟲防治途徑非常必要。

RNAi干擾(RNA interference,RNAi)是指由雙鏈RNA(double-strand RNA,dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異性地誘導(dǎo)與之同源互補的mRNA降解,使相應(yīng)基因的表達(dá)關(guān)閉,從而引發(fā)的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。這種現(xiàn)象是生物為保護自身基因組免受外源(如病毒)和內(nèi)源性(如轉(zhuǎn)座元件)序列的侵襲,特異性地調(diào)節(jié)或干擾基因表達(dá)的一種自身防御“免疫”應(yīng)答現(xiàn)象。

關(guān)于線蟲研究中,已發(fā)現(xiàn)線蟲體內(nèi)存在著能把RNAi信號放大和傳遞的機制，微量的dsRNA就能引導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的RNAi效應(yīng),而且能夠傳遞到子代。dsRNA可以通過微注射進(jìn)入C.elegans成蟲,也可以把C.elegans成蟲浸泡在含有dsRNA的溶液中或者喂飼含有dsRNA的大腸桿菌。注射進(jìn)入的dsRNA很容易在干細(xì)胞中擴散引起RNAi,而且能將這種效應(yīng)傳遞到子代。這種方法產(chǎn)生的表型外顯率高,非常適合胚胎基因的功能研究。然而注射法需要體外合成dsRNA和手工注射操作,費時、花費高而且技術(shù)難度大,很難用于大規(guī)模的功能分析。浸泡法是將線蟲浸泡于高濃度的dsRNA溶液。相比注射法,浸泡法能夠同時對大量的線蟲材料進(jìn)行處理。但是,浸泡法同樣需要體外合成大量的dsRNA(一般為1-5mg/ml),成本很高。與注射法和浸泡法比較，喂飼法有其獨特的優(yōu)勢。喂飼法通過構(gòu)建特殊載體,細(xì)菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA,再喂飼線蟲,可以有效抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)，省錢省事,并且可大規(guī)模進(jìn)行實驗。因而,如果建立一個RNAi細(xì)菌喂飼文庫,該方法就可高效地研究大批基因的功能，從而找出可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中線蟲的防治方法。