[發明專利]重組人骨形態發生蛋白-2的制備方法

有效

• 申請號: 201410405887.2
• 申請日: 2014-08-15
• 公開（公告）號: CN104151419B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 劉爽;鄧小霞;龐玉;王子華;孫曉悅
• 申請（專利權）人: 吉林金梓源生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/51
• 分類號: C07K14/51;C07K1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種在大腸桿菌中以包涵體形式表達重組人骨形態發生蛋白-2的制備方法，其包括如下步驟：高壓勻漿破碎菌體細胞、漂洗包涵體和調節不同pH值、變性溶解所述包涵體蛋白、所述包涵體蛋白控速復性、離心、超濾膜濃縮、過濾除菌、冷凍干燥制成成品步驟。

2.如權利要求1所述的方法，其中，所述漂洗包涵體和調節不同pH值步驟是用含有0.1-5％的去污劑的去離子水和調節不同的pH值至2-10，漂洗包涵體3-5次。

3.如權利要求2所述的方法，其中，所述去污劑為曲拉通X-100。

4.如權利要求1所述的方法，其中，所述包涵體蛋白控速復性步驟為：添加水或緩沖液降低尿素濃度來實施的。

5.如權利要求1所述的方法，其中，所述尿素控速復性該包涵體蛋白步驟是通過控制添加水或緩沖液的流速為1-100mL/分鐘來實現的。

6.如權利要求1所述的方法，其中，所述尿素控速復性該包涵體蛋白步驟是通過控制添加水或緩沖液的流速為5-20mL/分鐘來實現的。

7.如上述權利要求所述的方法，其中，所述超濾膜濃縮的步驟是用截留分子量為10000道爾頓-35000道爾頓的超濾膜進行反復超濾濃縮。

8.如權利要求7所述的方法，其中，所述的方法包括的步驟如下：

1)新發酵獲得的重組人骨形態發生蛋白-2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在≦10℃條件下進行破菌；

2)用螺罐式連續高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0.5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；

3)沉淀轉移至攪拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為8.5-10.0，在≦20℃攪拌2小時,用螺罐式連續高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0.5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；

4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為6.0-8.5，在≦20℃攪拌2小時,用螺罐式連續高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0.5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；

5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為2.0-6.0，在≦20℃攪拌2小時,用螺罐式連續高速離心機15000轉/分鐘離心，離心

0.5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；

6)步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含1mM?Beta-巰基乙醇的8M尿素溶液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解；

7)用螺罐式連續高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0.5-2小時，收集澄清液體，棄除產生的少量黑色沉淀雜質；

8)澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水的流速為2-20mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M；

9)用螺罐式連續高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0.5-2小時，收集澄清液體；

10)用截留分子量為1000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/5-1/10體積；

11)加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積；

12)用截留分子量為26000-35000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；

13)用截留分子量為1000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/10-1/50體積；14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。