[發(fā)明專利]基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人呼吸道合胞病毒快速檢測(cè)方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410405741.8
• 申請(qǐng)日: 2014-08-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105319373B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡征;楊波;董俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 董俊
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531;G01N33/533
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所42001
• 代理人: 余曉雪,王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗原的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，以及該檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。

背景技術(shù)

呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus，RSV)是一種RNA病毒，屬副粘液病毒科。該病經(jīng)空氣飛沫和密切接觸傳播。多見(jiàn)于新生兒和6個(gè)月以內(nèi)的嬰兒。潛伏期3～7日。嬰幼兒癥狀較重，可有高熱、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表現(xiàn)為細(xì)支氣管炎及肺炎。少數(shù)病兒可并發(fā)中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年長(zhǎng)兒童感染后，主要表現(xiàn)為上呼吸道感染。

WHO數(shù)據(jù)顯示，全球每年的呼吸道合胞病毒感染者約有6400萬(wàn)例，16萬(wàn)例死亡。近十年來(lái)合胞病毒肺炎及毛細(xì)支氣管炎占我國(guó)嬰幼兒病毒性肺炎第一位，其癥狀與副流感病毒肺炎、輕癥流感病毒肺炎及輕癥腺病毒肺炎臨床上幾乎無(wú)法區(qū)別，不做病原學(xué)檢查，很難確診呼吸道合胞病毒感染。因此建立簡(jiǎn)便、快速、可行、能早期診斷呼吸道合胞病毒感染的方法非常必要。

目前呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法主要有3類：一是分離培養(yǎng)法，其是證實(shí)感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，操作步驟較多，導(dǎo)致該法在臨床上不能進(jìn)行快速診斷；二是血清學(xué)方法，即采用酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗(yàn)等，檢測(cè)被檢者血清中呼吸道合胞病毒抗體水平，可間接提示呼吸道合胞病毒感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診斷，而且有時(shí)需要雙份血清。另外，抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存在呼吸道合胞病毒特異性抗體的差異，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測(cè)質(zhì)量受到一定限制；三是利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)呼吸道合胞病毒DNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前研究人呼吸道合胞病毒感染的重要手段，但由于PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，在我國(guó)還不能作為常用的臨床診斷方法。因此，建立人呼吸道合胞病毒特異性抗原診斷方法十分必要。目前，已公開(kāi)報(bào)道的檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗原的方法主要為雙抗夾心ELISA法、膠體金免疫層析法、間接免疫熒光法等，但這些方法或存在操作步驟繁多、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，或存在檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)成本高等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)背景技術(shù)中存在的這些技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的能簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗原的檢測(cè)方法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗原的方法，其特征在于：所述該方法包括以下步驟：

1)兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體的制備；

2)鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體的制備；

3)將步驟1)制備得到的兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體與納米磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備抗人呼吸道合胞病毒免疫納米磁珠；

4)將步驟2)制備得到的鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體與納米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人呼吸道合胞病毒納米探針；

5)取人呼吸道分泌物樣本(包括但不限于咽拭子)，用樣品處理液溶解后，加入步驟3)制備得到的抗人呼吸道合胞病毒免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液(8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，0.5ml/LTween-20；pH7.4)洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人呼吸道合胞病毒納米探針，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值；所述樣品處理液中各組分含量分別為8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，5ml/LNonidetP-40，5ml/LTritonX-100，所述樣品處理液的pH＝7.4；