[發明專利]基于磁性分離和量子點標記的人肺炎鏈球菌快速檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201410405100.2
• 申請日: 2014-08-18
• 公開（公告）號: CN105277713B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 胡征;楊波;董俊
• 申請（專利權）人: 董俊
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N33/533
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 余曉雪,王敏鋒

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，具體為一種基于磁性分離和量子點標記的檢測人肺炎鏈球菌抗原的快速檢測方法及檢測試劑盒，以及該檢測試劑盒的制備及使用方法。

背景技術

人肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，Sp)是兒童呼吸道感染的重要病原體。主要經飛沫傳播而進入呼吸道，從而寄生于人體的鼻咽部，或侵入人體不易清除的部位引起一系列的疾病，如大葉性肺炎，腦膜炎，支氣管炎，中耳炎等。它是全球所有年齡組高發病率和病死率的主要病原菌。其中，在發展中國家，嬰幼兒、老年人及免疫缺陷人群中尤為嚴重。肺炎鏈球菌于1881年首次由巴斯德(LouisPasteur)及G.M.Sternberg分別在法國及美國從患者痰液中分離出。其為革蘭氏染色陽性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，有毒株菌體外有化學成分為多糖的莢膜。其莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依據。根據莢膜多糖抗原性的不同將肺炎球菌分為91個血清型。肺炎鏈球菌菌體抗原主要為C多糖，其存在于肺炎鏈球菌細胞壁中，具有種特異性，為各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反應蛋白沉淀。在鈣離子存在時，C多糖可與正常人血清中稱為C-反應蛋白(Creactiveprotein，CRP)的β球蛋白結合，發生沉淀。目前針對人肺炎鏈球菌抗原的檢測亦主要是針對此抗原，而該抗原非肺炎鏈球菌獨有，如緩和鏈球菌亦含有該抗原。在肺炎鏈球菌表面還有一種與毒力相關的重要抗原，為肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)，其存在于肺炎鏈球菌所有血清型中，是肺炎鏈球菌的特異性抗原。但是PspA分子結構高度變異，具有抗原多樣性，其富含脯氨酸的結構域上游被稱為CDR域，具有多樣性。根據CDR域的不同將PspA分為3個家族6亞類：Clade1，Clade2，Clade3，Clade4，Clade5，Clade6。其中Clade1，Clade2屬于Fam1家族；Clade3，Clade4，Clade5屬于Fam2家族，Clade6屬于Fam3家族。具有Fam1或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎鏈球菌占到了臨床分離的人肺炎鏈球菌種類的99％以上。我國目前還未見具有fam3家族PspA蛋白的肺炎鏈球菌的臨床分離報道。研究表明同一家族亞類間PspA蛋白間存在廣泛的抗原抗體交叉反應，而異家族亞類間則無此交叉反應。

臨床病人由于不同的呼吸道病原體(如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病癥狀可以十分相似，這導致了流行診斷比較困難，確診往往依賴于實驗室診斷。快速有效的診斷方法應該是在疾病的發病初期就可以得到明確的診斷，便于實施針對性的治療，阻止病情的發展遷延。

盡管肺炎鏈球菌在全球范圍內傳播，嬰幼兒的感染尤其普遍，但可用于實驗室診斷的標準化商品試劑的種類極少。目前，肺炎鏈球菌的檢測主要有以下幾種方法：

一、常規實驗室檢測

1、細菌分離

實驗室診斷肺炎鏈球菌的金標準是分離人肺炎鏈球菌毒株。采用鼻咽分泌物作為病原體分離的標本，可以用血培養的方法分離病原體。但是該法有嚴重的缺陷，因為肺炎鏈球菌是苛養菌，營養要求高，培養所需時間長，陽性率低，更重要的是，若采樣前患者使用過抗菌藥物，會造成培養結果的假陽性。這樣在臨床方面對病人的治療就有一定的局限性。

2、血清學檢測

即采用酶聯免疫法、放免法、微量免疫熒光法等，檢測被檢者血清中肺炎鏈球菌抗體水平，可間接提示肺炎鏈球菌感染的存在。然而，血清學試驗只能提供一種回顧性的診斷，它需要同時檢測患者急性期和恢復期的雙份血清，如果恢復期中抗人肺炎鏈球菌抗體效價比急性期高4倍或4倍以上才有診斷意義。另外，抗體出現的時機不易掌握，且因為菌體血清型種類過多，導致其誘生的抗莢膜多糖抗體種類過多，對抗體的檢測造成了很大的困難，故現有血清學方法的檢測質量受到一定限制。

二、快速診斷

直接檢查人肺炎鏈球菌蛋白抗原和菌體核酸可達到快速診斷的目的，目前主要有膠體金免疫層析法、免疫熒光法、免疫酶法和PCR法等。免疫熒光法和免疫酶法均存在操作步驟復雜，需要專業人員操作，檢測時間長(2h以上)，成本較高等缺點。PCR方法快速、靈敏、特異，是目前研究肺炎鏈球菌感染的重要手段，但由于PCR對實驗設備以及操作要求較高，且易出現假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。膠體金免疫層析法的檢測目標抗原為C多糖抗原，但是膠體金法敏感度較低，對樣品材料質量要求較高，同時還存在與其他鏈球菌如緩和鏈球菌存在交叉反應等缺陷。因此，建立具備高靈敏度的人肺炎鏈球菌特異性抗原快速診斷法十分必要。

發明內容