[發(fā)明專利]檢測(cè)血液中微生物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410404534.0
• 申請(qǐng)日: 2014-08-18
• 公開（公告）號(hào): CN105372186B
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王龍;胡維;冉葦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司;上海星佰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/31
• 分類號(hào): G01N21/31;G01N1/28
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責(zé)任公司 31203
• 代理人: 陸林輝

本發(fā)明提供一種檢測(cè)血液中微生物的方法，該方法包括下列步驟：(1)將2,3,5‐三苯基氯化四氮唑(TTC)直接加入血培養(yǎng)瓶；或2,3,5‐三苯基氯化四氮唑混合到硅橡膠富氧膜中，制備成固體指示劑，并固定在血培養(yǎng)瓶底部；所述TTC濃度為0.01‐0.03g/mL；(2)向血培養(yǎng)瓶中加入血培養(yǎng)基，并于121℃，滅菌20min；(3)向血培養(yǎng)瓶中加入血液樣品，在35℃條件下培養(yǎng)0‐5天后；(4)檢測(cè)血培養(yǎng)瓶中指示帶的光反射強(qiáng)度，繪制光反射強(qiáng)度曲線，根據(jù)光反射強(qiáng)度曲線確定微生物生長(zhǎng)結(jié)果。本發(fā)明在臨床應(yīng)用上具有成本低、操作流程簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、陽(yáng)性檢出率高等優(yōu)點(diǎn)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體微生檢測(cè)方法，尤其涉及一種檢測(cè)血液中微生物的方法。

背景技術(shù)

血培養(yǎng)是臨床實(shí)驗(yàn)室重要的檢測(cè)項(xiàng)目之一，由于菌血癥、敗血癥的死亡率高達(dá)30-50％，因此，準(zhǔn)確及時(shí)的培養(yǎng)結(jié)果對(duì)臨床檢測(cè)和治療有重要意義。目前中國(guó)內(nèi)血培養(yǎng)中細(xì)菌的陽(yáng)性檢出率僅為10％，其可能原因?yàn)椋?、血液中的含菌量低；2、血液中的抗菌物質(zhì)；3、抗生素的應(yīng)用；4、培養(yǎng)條件的限制。目前市場(chǎng)上的血培養(yǎng)檢測(cè)產(chǎn)品主要以CO₂檢測(cè)法為主，主要的測(cè)定技術(shù)有放射性標(biāo)記技術(shù)、熒光檢測(cè)技術(shù)和分光光度技術(shù)。因細(xì)菌在其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生CO₂，這些技術(shù)的原理都是通過(guò)檢測(cè)血液樣品在培養(yǎng)過(guò)程中中是否有CO₂的產(chǎn)生來(lái)判定血液中是否有微生物。但這種基于細(xì)菌產(chǎn)生CO₂的檢測(cè)方法，會(huì)因?yàn)橐恍┎荒芾锰谴x的微生物(如非發(fā)酵菌)，其代謝過(guò)程不產(chǎn)生CO₂或產(chǎn)生的CO₂量極低，從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果呈陰性。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作為一種特殊的氧化還原指示劑，可以捕捉細(xì)胞或細(xì)菌呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的電子，從無(wú)色的氧化型變成紫色的還原型，從而可以檢測(cè)出血液中不產(chǎn)生CO₂的微生物。用TTC作指示劑有陽(yáng)性檢出率高，檢出時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于提高血培養(yǎng)技術(shù)有重要幫助。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究設(shè)計(jì)采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作為一種特殊的氧化還原指示劑來(lái)檢測(cè)血液中是否含有微生物，達(dá)到提高血培養(yǎng)技術(shù)的效果。

本發(fā)明提供一種檢測(cè)血液中微生物的方法，該方法包括下列步驟：

(1)將2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)與血培養(yǎng)基加入血培養(yǎng)瓶，再加入35-40mL血培養(yǎng)基及2-4g樹脂粒，所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑在血培養(yǎng)基及樹脂粒混合物中濃度為0.01-0.03g/mL；或

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡膠富氧膜中，制備成固體指示劑，并固定在血培養(yǎng)瓶底部，再加入35-40mL血培養(yǎng)基及2-4g樹脂粒；所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑在硅橡膠富氧膜中濃度為0.01-0.03g/mL；

(2)血培養(yǎng)瓶于121℃，滅菌20min；

(3)向血培養(yǎng)瓶中加入血液樣品，在34-36℃條件下培養(yǎng)0-5天；

(4)檢測(cè)血培養(yǎng)瓶中指示帶的光反射強(qiáng)度，繪制光反射強(qiáng)度曲線，根據(jù)光反射強(qiáng)度曲線確定微生物生長(zhǎng)結(jié)果。

本發(fā)明方法所述步驟(1)硅橡膠富氧膜為：25mL的聚二甲基硅氧烷、750μL正桂酸乙酯、100μL二月桂酸二丁基錫和1.25mL環(huán)己烷混合物。

所述步驟(1)TTC先用等質(zhì)量的單蒸水溶解再應(yīng)用。