[發明專利]一種針對EGFR靶向治療藥物的生物學活性檢測方法

有效

• 申請號: 201410403694.3
• 申請日: 2014-08-15
• 公開（公告）號: CN105334207A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發明（設計）人: 劉培培;廖輝輝;劉偉旭;譚青喬
• 申請（專利權）人: 上海中信國健藥業股份有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種針對EGFR靶向治療藥物的生物活性檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

(1)細胞鋪板：取對數生長期高表達EGFR的細胞制成細胞懸液，分別加入細胞培養板孔中，然后將細胞培養板置于培養箱中培養，使細胞貼壁；

(2)參考品及供試品稀釋：取參考品及供試品，根據標示濃度，先預稀釋至一定濃度，再進行系列梯度稀釋；

(3)加樣：將步驟(2)稀釋好的系列梯度濃度的參考品及供試品依次加入步驟(1)中的細胞培養板孔中，然后將細胞培養板置于培養箱中培養；

(4)顯色：采用檢測活細胞或死細胞量的檢測體系對細胞培養板進行顯色反應；

(5)測定分析：步驟4顯色反應完成后，取出細胞培養板混勻，放入酶標儀，對顯色反應結果進行測定，并根據測定結果計算供試品的細胞增殖抑制生物學活性。

2.根據權利要求1所述的生物學活性檢測方法，其特征在于，所述高表達EGFR的細胞是人表皮癌細胞A-431。

3.根據權利要求1或2所述的生物活性檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述的細胞鋪板是通過取對數生長期高表達EGFR的細胞經胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，計數并調整至合適的細胞密度，以100μl/孔加入96孔細胞培養板中，然后將細胞培養板置于37℃，5％二氧化碳培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。

4.根據權利要求1或2所述的生物活性檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述系列梯度稀釋是7-11個稀釋度。

5.根據權利要求1或2所述的生物活性檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述加樣是將步驟(2)稀釋好的系列梯度濃度的參考品及供試品以100μl/孔依次加入步驟(1)所述的細胞培養板中，然后將細胞培養板放置于37℃，5％二氧化碳培養箱中培養68-74小時。

6.根據權利要求1或2所述的生物活性檢測方法，其特征在于，步驟(5)所述供試品細胞增殖抑制生物學活性是通過以下方法獲得，用參考品孔和供試品孔測定值與加樣濃度的量效關系進行4參數擬合，確定參考品與供試品的EC₅₀值，曲線擬合常數R²，并按照下列公式計算供試品的細胞增殖抑制生物學活性：

7.根據權利要求3所述的生物學活性檢測方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述細胞密度是(3-8)×10⁴個/mL。

8.根據權利要求1或2所述的生物學活性檢測方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的參考品溶液和供試品溶液濃度預稀釋至0.5-20ug/mL；所述系列梯度稀釋是1.5-2倍系列梯度稀釋。

9.根據權利要求1或2所述的生物學活性檢測方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述檢測活細胞或死細胞量的檢測體系包括但不限于：四唑類化合物氧化還原檢測體系、ATP總量檢測體系或LDH釋放量檢測體系；所述四唑類化合物包括但不限于：MTT、MTS、CCK-8，優選為CCK-8。

10.根據權利要求1-9任一所述的生物學活性檢測方法，其特征在于，所述EGFR靶向治療藥物是單克隆抗體、融合蛋白、激酶抑制劑、反義寡核甘酸、化合物、中藥提取物或中藥復方提取物之一或它們的任意組合，優選單克隆抗體，為尼妥珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗。