[發明專利]一種穩定的總膽汁酸檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410401471.3
• 申請日: 2014-08-14
• 公開（公告）號: CN104198420A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 李偉奇;李杰;房君江;張秀文;林清玉
• 申請（專利權）人: 上海睿康生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N33/53;G01N35/00
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明涉及醫學免疫體外診斷領域，具體地，涉及一種穩定的總膽汁酸檢測試劑盒。

背景技術

正常人肝臟合成的膽汁酸有膽酸(CA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)和代謝中產生的脫氧膽酸(DCA)還有少量石膽酸(LCA)和微量熊脫氧膽酸(UDCA)，合稱總膽汁酸(TBA)。

人體血清總膽汁酸(TBA)是由肝臟合成并分解代謝，從而維持人體膽汁酸的相對穩定，它的調控是肝臟的一個主要功能。當肝細胞發生病變或患膽管疾病時可引起膽汁的代謝障礙，使進入血中的膽汁酸含量顯著升高，血清TBA升高與肝細胞損傷程度成正比。

膽汁酸是膽固醇在肝臟分解代謝的產物，膽汁是由肝臟分泌到膽汁中，并隨膽汁排入腸腔，作用于脂肪的消化吸收。膽汁酸在腸腔經細菌作用后，95％以上的膽汁酸被腸壁吸收經門靜脈血重返肝臟利用，稱為膽汁酸腸-----肝循環。故正常人血中膽汁酸濃度很低。膽汁酸的生成和代謝與肝臟有十分密切的關系，一旦當肝細胞發生病變，血清TBA很容易升高，因而血清TBA水平是反映肝實質損傷的一項重要指標。

各類肝膽疾病的TBA升高：急性肝炎與肝癌均為100％，肝硬化為87.5％，慢性肝炎、膽道疾病也達65％以上。說明了肝膽疾病中TBA測定比傳統肝功能指標任何一項都敏感。

急性肝炎與慢性肝炎的TBA有差異：急性肝炎時患者血清TBA與丙氨酸轉氨基酶(ALT)一樣，呈顯著增高，平均增高幅度是正常的31倍，說明TBA對急性肝炎早期診斷價值與ALT(陽性率100％)測定相同，經積極治療后隨肝細胞損害的控制很快轉為正常，而TBA則隨肝功能的恢復逐漸轉為正常。慢性肝炎時，TBA陽性率為65.7％，平均升高幅度為正常的10倍。

肝癌、肝硬化時，由于肝臟對TBA代謝功能下降，故血清TBA在不同階段都增高。當肝癌時，TBA陽性率為100％，而肝硬化TBA陽性率為88％，亦高于其他指標。當轉氨酶、膽紅素及堿性磷酸酶等其他指標轉為正常情況下，血清中TBA水平仍很高，這可能由于肝細胞功能失調，肝實質細胞減少等原因有關。

膽汁酸不但參與脂質的消化吸收，同時可維持膽汁中膽固醇的可溶性狀態，當膽汁酸代謝導致膽固醇性膽石的形成，膽石形成阻塞加重膽汁酸的代謝異常，其陽性率明顯高于其他肝功能指標。血清中TBA水平顯著增高，隨炎癥的阻塞階段不同而變化，但隨著炎癥消失或阻塞引流解除后，TBA水平迅速下降，其他指標亦隨之正常。由此可見，TBA測定是一個良好的肝功能指標，能反映肝實質損傷的一項重要指征。

診斷方法：膽汁酸作為從膽固醇轉化形成的類固醇，其分子上3α-羥基對3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)的酶催化作用比較敏感，膽汁酸C3上α位的羥基在3α-HSD的作用下脫氫形成羰基，此酶促反應的輔酶是氧化型輔酶I(NAD+)，反應后NAD+作為受氫體轉化成還原型輔酶I(NADH)。根據這一酶法反應的原理發展出幾種可以適合臨床實驗室進行膽汁酸分析的方法。1974年挪威科明公司采用純制的3α-羥基類固醇成功的生產出第一代酶法膽汁酸試劑，使膽汁酸的測定真正進入臨床領域，到現今，膽汁酸的檢測已經發展到了第5代循環酶法。此法的反應體系中引入輔酶I的一種硫代衍生物，其反應原理如下：膽汁酸被3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)氧化，生成3-酮類固醇，脫下的氫被Thio-NAD接受，使Thio-NAD轉化為Thio-NADH；同時在反應體系中還存在NADH時，3α-HSD又催化逆向反應，使正反應生成的3-酮類固醇又氧化成為膽汁酸，完成一個循環。經如此反復循環的酶反應，Thio-NADH的生成量不斷增大，在一定時間內，酶循環產生的β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(Thio-NADH)量與樣品中膽汁酸濃度成正比。Thio-NADH在395nm～415nm波長處有光吸收峰，可在自動生化分析儀器內連續監測410nm的吸光度變化，求得膽汁酸的濃度。

但是，上述測定方法還存在著問題，由于NADH在溶液中很難長時間的保存，使得試劑穩定性差，保存時間短。而NADH又是循環反應中主要的物質，NADH含量的變化對試劑檢測性能的影響非常大。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種穩定的總膽汁酸檢測試劑盒。本發明對膽汁酸檢測的第5代循環酶法加以改進，通過加入抗氧化酶，使NADH能長時間保存，提高試劑穩定性。同時加入抗氧化酶后，去除了反應過程中很多干擾成分所帶來的影響，使得NADH更高效的利用，提高循環反應的速度，使得檢測靈敏度更高，線性范圍更廣。

本發明是通過以下技術方案實現的：