[發(fā)明專利]馬鈴薯病毒檢測引物及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410400016.1
• 申請日: 2014-08-14
• 公開（公告）號: CN104178585A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李華偉;湯浩;羅文彬;紀(jì)榮昌;許泳清;邱思鑫;劉中華;邱永祥
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)京華專利事務(wù)所(普通合伙) 35212
• 代理人: 王美花

1.一種馬鈴薯病毒檢測引物，其特征在于：具體包括如下五個引物對：

馬鈴薯X病毒引物對：上游引物5'-CTGGCAAGCACAAGGTTT-3'，下游引物5'-TGGGCAGCATTCATTTCA-3'；

馬鈴薯M病毒引物對：上游引物

5'-GCCGACTGAGCACGTGCAGCAGGT-3'，下游引物5'-

GTCAGCATATGATTCCATGTCACCGG-3'；

馬鈴薯Y病毒引物對：上游引物5'-AGAGCAAGGCAGCATCCAGT-3'，下游引物5'-TGTTCATCCCCATCCATCAT-3'；

馬鈴薯A病毒引物對：上游引物5'-ATTTAGGTACTGCTGGGACT-3'，下游引物5'-TCAGGTTGCGTTGAAGAC-3'；

馬鈴薯S病毒引物對：上游引物5'-TGTAGAGGAGCATAGAGTTGG-3'，下游引物5'-CTTGTGGGCATTGTGAGC-3'。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯病毒檢測引物，其特征在于：所述馬鈴薯X病毒引物對對馬鈴薯X病毒PCR擴(kuò)增出138bp的產(chǎn)物；所述馬鈴薯M病毒引物對對馬鈴薯M病毒PCR擴(kuò)增出213bp的產(chǎn)物；所述馬鈴薯Y病毒引物對對馬鈴薯Y病毒PCR擴(kuò)增出369bp的產(chǎn)物；所述馬鈴薯A病毒引物對對馬鈴薯A病毒PCR擴(kuò)增出468bp的產(chǎn)物；所述馬鈴薯S病毒引物對對馬鈴薯S病毒PCR擴(kuò)增出657bp的產(chǎn)物。

3.一種馬鈴薯病毒檢測方法，其特征在于：根據(jù)馬鈴薯X病毒、馬鈴薯M病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒及馬鈴薯S病毒五種病毒的外殼蛋白序列保守區(qū)域分別設(shè)計合成出如權(quán)利要求1中所述馬鈴薯X病毒引物對、馬鈴薯M病毒引物對、馬鈴薯Y病毒引物對、馬鈴薯A病毒引物對及馬鈴薯S病毒引物對；然后建立RT-PCR檢測體系，并利用所述馬鈴薯X病毒引物對對馬鈴薯葉片中的馬鈴薯X病毒、馬鈴薯M病毒引物對對馬鈴薯葉片中的馬鈴薯M病毒、馬鈴薯Y病毒引物對對馬鈴薯葉片中的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒引物對對馬鈴薯葉片中的馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒引物對對馬鈴薯葉片中的馬鈴薯S病毒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳分析和PCR產(chǎn)物克隆測序比對。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的馬鈴薯病毒檢測方法，其特征在于：所述RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：

反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為25μL，含2.0μL模板、0.15μL5U·μL^-1的Ex?Taq酶，2.0μL2.5mmol·L^-1的dNTP，2.5μL的10×PCR?buffer、0.30μL10μmol·L^-1的馬鈴薯X病毒上游引物、0.30μL10μmol·L^-1的馬鈴薯X病毒下游引物、0.05μL10μmol·L^-1的馬鈴薯M病毒上游引物、0.05μL10μmol·L^-1的馬鈴薯M病毒下游引物、0.30μL10μmol·L^-1的馬鈴薯Y病毒上游引物、0.30μL10μmol·L^-1的馬鈴薯Y病毒下游引物、0.15μL10μmol·L^-1的馬鈴薯A病毒上游引物、0.15μL10μmol·L^-1的馬鈴薯A病毒下游引物、0.2μL10μmol·L^-1的馬鈴薯S病毒上游引物、0.2μL10μmol·L^-1的馬鈴薯S病毒下游引物、其余成分為ddH₂O；

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃延伸l0min，4℃保存。