[發明專利]一種人干擾素IFN-α2b與LL-37的融合蛋白

在審

• 申請號: 201410399726.7
• 申請日: 2014-08-14
• 公開（公告）號: CN105713093A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 萬徐萍
• 申請（專利權）人: 廣東紫金正天藥業有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61P31/12;A61P31/00;C12P21/02
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技術領域

本發明屬于生物工程技術領域

背景技術

蛋白的結構常常可以容許包括整個結構域的插入與融合，在自然界中，通過結構域的插入與融合從而形成大的多功能蛋白是一種較為普遍存在的現象。重組DNA技術的應用使得不同基因或基因片段的融合可以比較方便地進行，融合的基因經表達后即可得到由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多結構域的人工蛋白，這是一種極具潛在應用價值與理論意義的方法。目前這種方法已被廣泛應用于許多領域的研究中，并已顯示出較高的價值。基因融合技術最早即是被用來在細菌(主要是大腸桿菌)中表達外源蛋白，對于外源基因，利用融合表達的方法在大腸桿菌中表達有很多優點，一是由于外源基因一般是被連接到可供融合的蛋白的C端編碼序列之后，因此不需另外設SD序列，同時，N端融合基因的存在，使得外源基因的表達相對比較容易。其二是外源基因的表達產物常常會被宿主細胞的蛋白酶所降解，當外源基因與宿主本身的某種蛋白(如β一半乳糖普酶)的部分編碼序列構成融合基因，以融合蛋白的形式表達時，往往會減低宿主細胞對產物的降解。除此之外，利用融合蛋白的形式表達外源基因產物還有以下的一些特殊的優點，包括：通過融合表達為蛋白純化提供便利；通過融合表達的方式促使產物以包涵體的形式表達等。故本發明將人干擾素-α2b和人LL-37融合。

IFN-α2b是由165個氨基酸組成的單鏈多肽，Cys¹和Cys⁹⁸，Cys²⁹和Cys¹³⁸組成二條二硫鍵。人LL-37全長37個氨基酸，分子內無二硫鍵，其N端絲氨酸被乙酞化，但缺少乙酞化對其活性影響不大。由于基因工程菌的重組人LL-37無法實現乙酞化，為此考慮將人LL-37置于融合蛋白的C端。因此如何設計一個適合連接肽是該分子設計的關鍵。若連接肽太長，兩個藥物的協同作用可能減弱，若太短，可能影響到干擾素α2b與受體的結合，只有適宜的連接肽不僅將兩個藥物連接成一個大分子，而且不會影響到兩個藥物保持各自的功能。該融合蛋白采用十幾個氨基酸殘基的連接肽，使得兩個藥物不僅較好地保持各自的功能，而且具有協同效果。

發明內容

1.人LL-37與IFN-α2bDNA序列的密碼子優化

在保證人LL-37與IFN-α2b氨基酸序列完整性的前提下，按照P.pastoris對密碼子的偏好性特點，對他們的DNA序列進行優化。

2重組人干擾素α2b和人LL-37融合蛋白表達載體構建

分別用EcoRI和NotI雙酶切pPIC9K和pMD-18Fall-IFN質粒，經凝膠電泳后切膠分別回收約9300bp和600bp的片斷，用膠回收試劑盒回收片斷，并用T4ligase連接，構建分泌型重組質粒pPIC9K-Fall-IFN，用CaCl法轉化大腸桿菌DH5α，利用LB-Amp平板篩選重組子。挑選陽性轉化子送上海生工進行測序，確定質粒的結構。

3重組質粒轉化畢赤酵母

用SacI單酶切pPIC9K-Fall-IFN成線性重組質粒，通過電擊轉化法將其轉入P.pastorisGS115中構建重組菌P.pastorisGS115LI。電擊條件為1500kV，200Ω，25μF。轉化液涂布于MD平板30℃靜止培養3天，挑選陽性克隆，搖瓶后，用真菌基因組提取試劑盒提取基因組進行PCR鑒定。引物為：SenseP1：ATGTGTGACCTACCACAAACCCACA，AntisP2：GGACTCTGTCCTGGGTACAAGATT，退火溫度為58℃，以GS115基因組及未加模板的體系為對照組。

4重組菌表型鑒定及多拷貝篩選

通過甲醇利用情況進行重組菌表型鑒定。將PCR鑒定的陽性轉化子編號，并將每菌株用滅菌牙簽同時接種MD和MM平板，30℃靜止培養5天，觀察各菌株在兩種平板上的生長情況。

通過遺傳霉素(G418)濃度梯度篩選多拷貝重組株。首先制備遺傳霉素質量濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的YPD平板，然后將前面篩選的表型正常的重組菌株用滅菌牙簽點在5個遺傳霉素梯度平極上，30℃靜止培養4天，觀察結果，能在高濃度下生長良好的菌株為多拷貝菌株。

5融合蛋白發酵與純化