[發(fā)明專利]基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410398360.1
• 申請日: 2014-08-13
• 公開（公告）號: CN104195646A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設計）人: 徐安龍;付永貴;顏慶瑜
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法包括以下步驟：

(1)根據基因多態(tài)性區(qū)域特征，設計一對分別位于多態(tài)性區(qū)域上游以及下游保守位點的引物，通過PCR擴增得到包含基因保守區(qū)域和多態(tài)性區(qū)域的DNA片段；

(2)向步驟(1)PCR擴增所得DNA片段中加入核酸外切酶，控制核酸外切酶的濃度與反應時間或者控制核酸外切酶的反應溫度與反應時間，水解DNA片段；

(3)向步驟(2)所得DNA片段的水解產物中加入單鏈核酸酶，孵育，消化DNA突出單鏈，得到DNA混合片段；

其中，所述步驟(1)的引物中，至多一條引物帶有保護DNA不被核酸酶水解的化學修飾。

2.如權利要求1所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法還包括步驟(4)：將步驟(3)所得DNA混合片段直接連接測序接頭，得到測序文庫。

3.如權利要求1所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述化學修飾為硫代磷酸化修飾、以2'-O-甲基或以2'-O-乙基進行的修飾。

4.如權利要求3所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述化學修飾為前6個堿基進行了硫代磷酸化修飾。

5.如權利要求1所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述核酸外切酶為T7外切核酸酶、Lambda外切核酸酶或外切核酸酶Ⅲ；所述單鏈核酸酶為S1核酸酶或綠豆核酸酶。

6.如權利要求1至5中任一項所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述多態(tài)性區(qū)域為T細胞TCR?CDR3區(qū)域。

7.如權利要求6所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述T細胞TCR?CDR3區(qū)域測序文庫制備方法中，步驟(1)中的上游引物如序列SEQ?ID?NO：6所示，下游引物如SEQ?ID?NO：7和SEQ?ID?NO：8所示。

8.如權利要求6所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述T細胞TCR?CDR3區(qū)域測序文庫制備中，步驟(2)中核酸外切酶是濃度為0.06U/μl-0.10U/μl的T7外切核酸酶，反應時間為30～120min。

9.如權利要求8所述的一種基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)中核酸外切酶是濃度為0.08U/μl的T7外切核酸酶，反應時間為40～50min，所述步驟(3)中單鏈核酸酶為S1核酸酶。

10.一種采用如權利要求1或2所述方法制備得到的基因多態(tài)性區(qū)域測序文庫。