[發(fā)明專利]一種去除肝素鈉中細菌內(nèi)毒素的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410397866.0
• 申請日: 2014-08-13
• 公開（公告）號: CN104193848A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設計）人: 唐詠群;黃錫偉;段艷冰;婁媛媛;劉玉輝
• 申請（專利權）人: 南京健友生化制藥股份有限公司
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;呂鵬濤

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及是一種在肝素鈉生產(chǎn)過程中去除細菌內(nèi)毒素的方法。

背景技術

肝素鈉(Heparin?Sodium)是含有硫酸酯的粘多糖，屬于不均一的多糖分子。分子結構用一個四糖重復單位表示如下：

肝素鈉的分子量在8000—24000范圍內(nèi)，是從健康生豬小腸黏膜中提取的由兩種多糖交替鏈接而成的多聚體，目前肝素是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應用于心腦血管疾病和血液透析治療，其在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物。臨床應用及研究顯示，肝素除具有抗凝血作用外，還具有其它多種生物活性和臨床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌細胞(SMC)增生、促進纖維蛋白溶解等作用。

由于肝素鈉結構復雜，目前還無法人工合成，中國生豬屠宰量占全球50％以上，擁有全球最豐富的肝素鈉原料資源，我國是全球肝素鈉粗品和肝素鈉原料藥的主要生產(chǎn)國，也是全球最大的肝素鈉原料藥出口國，擁有美國FDA認證或歐盟CEP認證標準的肝素原料藥已呈現(xiàn)供不應求的局面。

肝素鈉原料藥來源于肝素鈉粗品，含有大量雜質(zhì)蛋白、雜質(zhì)核酸、微生物等雜質(zhì)，需經(jīng)過物理和化學提取分離過程，定向獲取天然結構基團完整的肝素鈉，從而制成肝素鈉原料藥。從上游企業(yè)收購來的肝素鈉粗品中普遍都含有大量的細菌內(nèi)毒素，細菌內(nèi)毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放一種內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。內(nèi)毒素通過消化道進入人體時并不產(chǎn)生危害，但內(nèi)毒素通過注射等方式進入血液則會引起不同的疾病，內(nèi)毒素小量入血后被肝臟枯否細胞滅活，不造成機體損害，內(nèi)毒素大量進入血液就會引起發(fā)熱反應--“熱原反應”，因此注射用藥物必須經(jīng)過細菌內(nèi)毒素檢測合格后才能使用。中國藥典2010、歐洲藥典8.0、美國藥典USP35-NF30均對肝素鈉中細菌內(nèi)毒素給出了要求，分別為≤0.010EU/IU、≤0.01EU/USP?U和≤0.03EU/USP?U。但是目前還沒有相關的專利或文獻報道通過有效的方法來控制肝素鈉中細菌內(nèi)毒素這一項指標。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服肝素鈉中細菌內(nèi)毒素超標的問題，提供了一種在將肝素鈉粗品制備成肝素鈉原料的工藝過程中，采用添加高氯酸鹽并輔以其他手段有效的去除肝素鈉中的細菌內(nèi)毒素的方法。本發(fā)明通過在制備肝素鈉原料過程中加入高氯酸鹽、調(diào)節(jié)適宜的反應溫度和時間以及在其他條件的相互配合作用下，達到去除肝素鈉中細菌內(nèi)毒素的目的。該方法具有條件溫和、操作簡便、成本低、效果好的優(yōu)點，適于肝素鈉原料工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到：

一種去除肝素鈉中細菌內(nèi)毒素的方法，其包括如下步驟：

(1)取含有細菌內(nèi)毒素的肝素鈉粗品用純化水溶解，調(diào)節(jié)肝素鈉水溶液的pH值為8.0-9.0，在70-85℃下加入高氯酸鹽或其水溶液并進行反應；

(2)待反應結束后將反應液降溫至20-30℃，向其中加入乙二胺四乙酸，攪拌使其反應，然后通過硅藻土過濾，濾液再進行超濾；

(3)超濾得到的肝素鈉濃縮液升溫至45-55℃，加入乙醇，攪拌后降溫至10-15℃進行靜置或離心，然后除去上清液；

(4)向步驟(3)得到的下層沉淀物中加入純化水和氯化鈉溶解沉淀物，然后在45-55℃下加入乙醇并攪拌后降溫至10-15℃進行靜置或離心，除去上清液，得到去除了細菌內(nèi)毒素的肝素鈉。

本發(fā)明所指的肝素鈉粗品是指含有細菌內(nèi)毒素的各種純度的肝素鈉，一般其細菌內(nèi)毒素含量在10EU/USP?U以上，抗Ⅱa效價≥110USP?U/mg。

在步驟(1)和步驟(4)中測試的細菌內(nèi)毒素方法為：取細菌內(nèi)毒素國家標準品(簡稱RSE)1支，按照說明書復溶，漩渦混勻至少15min后，然后用鱟試劑將細菌內(nèi)毒素工作標準品稀釋成4λ、2λ濃度的內(nèi)毒素溶液。在進行每一步稀釋前，至少混合30s。精密稱取供試品200mg，根據(jù)樣品檢測得到的效價，用鱟試劑將樣品稀釋成6IU/ml(2C)、3IU/ml(C)濃度的供試品溶液，按照歐洲藥典的凝膠法進行操作；