[發(fā)明專利]基于質(zhì)譜的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)的分析方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410397766.8
• 申請日: 2014-08-13
• 公開（公告）號: CN105445358B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張麗華;夏思敏;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.基于質(zhì)譜的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)的分析方法，其特征為：首先將O-GlcNAc修飾糖蛋白質(zhì)采用蛋白酶酶解生成肽段；之后，以高碘酸鈉作氧化劑，對修飾的氮乙酰葡糖胺基團(tuán)上的鄰位羥基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)醛基基團(tuán)；利用吉拉德試劑T上的酰阱和新生成的醛基反應(yīng)，從而使糖肽化學(xué)衍生上季銨鹽基團(tuán)；然后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和分析;

通過二級質(zhì)譜獲得肽段的碎片信息，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫搜索等分析手段對該種糖基修飾的糖蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒別;

采用液質(zhì)聯(lián)用，對肽段進(jìn)行分離后采用質(zhì)譜進(jìn)行樣品分析；

利用碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-induced dissociation，CID）模式對肽段進(jìn)行二級碎裂，對于離子阱質(zhì)譜，CID能量控制在30-50%；采集數(shù)據(jù)利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫搜索引擎進(jìn)行糖肽的信息利用分析;

由于目前有多款通用的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫搜索引擎，其具體參數(shù)設(shè)置略有不同；

因此針對該氧連接氮乙酰葡糖胺修飾參數(shù)設(shè)置中，需做出特別調(diào)整的有：1)增加可變修飾的設(shè)置，修飾分子式C₁₃H₂₂N₄O₅，修飾位點(diǎn)絲氨酸和蘇氨酸殘基；2) 增加可變修飾的設(shè)置，修飾分子式C₁₈H₃₃N₇O₅，修飾位點(diǎn)絲氨酸和蘇氨酸殘基；3) 增加可變修飾：修飾分子式C₂H₄，修飾位賴氨酸殘基；4）修飾分子式C₂H₄，修飾位點(diǎn)肽段氮末端；搜庫結(jié)果進(jìn)一步處理，為增加結(jié)果的可信度，利用二級質(zhì)譜圖中的特征峰進(jìn)行進(jìn)一步篩選；對于修飾了一分子吉拉德試劑T的修飾肽段，二級譜中應(yīng)包含特征峰M/z=315.16，對于修飾了兩分子吉拉德試劑T的修飾肽段，二級譜中應(yīng)包含特征峰M/z=214.625。

2.按照權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征為：在對氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)變性還原烷基化后進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，獲得作為酶解產(chǎn)物的肽段；每100μg蛋白質(zhì)加入3-6 μl1 M二硫蘇糖醇（DTT），50-60 ℃反應(yīng)1-2 小時(shí)；之后加入8-12 μl 1 M 碘乙酸（IAA），避光反應(yīng)10-30 分鐘；將處理后的蛋白質(zhì)樣品利用碳酸氫銨緩沖液稀釋，pH值控制7.5-8.5之間，每100μg蛋白質(zhì)加入2-5 μg蛋白酶進(jìn)行酶解，36-38 ℃反應(yīng)16-24小時(shí)；酶解肽段利用反相液相色譜除去碳酸氫銨等小分子鹽，冷凍干燥后獲得的肽段樣品進(jìn)行甲醛二甲基化方法封閉N末端氨基。

3.按照權(quán)利要求1或2所述的分析方法，其特征為：為避免肽段N末端是絲氨酸或蘇氨酸殘基時(shí)存在的副反應(yīng)，采用甲醛二甲基化方法封閉N末端氨基，每100 μg肽段加入質(zhì)量濃度3-5%甲醛溶液10-25μl，0.5-0.8 mM氰基硼氫化鈉 10-25μl，反應(yīng)0.5-2小時(shí)，反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉；之后糖肽與高碘酸鈉反應(yīng)，對修飾的氮乙酰葡糖胺基團(tuán)上的鄰位羥基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)醛基基團(tuán)；對于過量的高碘酸鈉，采用亞硫酸鈉作還原劑終止反應(yīng)；之后加入吉拉德試劑T與新生成的醛基反應(yīng)，過量的吉拉德試劑T利用反相液相色譜分離除去。

4.按照權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征為：與氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖肽反應(yīng)的高碘酸鈉溶液濃度為20-30 mM；反應(yīng)溫度35-40 ℃，反應(yīng)時(shí)間4-8小時(shí)；氧化反應(yīng)結(jié)束后，加入4-6倍于高碘酸鈉摩爾量的亞硫酸鈉，反應(yīng)10-40 分鐘，終止氧化反應(yīng)；整個(gè)過程在pH=5-6的乙酸鈉溶液中進(jìn)行；將經(jīng)過高碘酸鈉氧化的糖肽與濃度為10 -100 mM的吉拉德試劑混合，反應(yīng)1-6小時(shí)；反應(yīng)過程在pH=5-6的乙酸鈉溶液中進(jìn)行；采用反相液相色譜分離除去未反應(yīng)吉拉德試劑。