[發明專利]一種牙鲆肌衛星細胞系的構建方法及其鑒定牙鲆肌衛星細胞標記基因的特異性引物和應用

在審

• 申請號: 201410396037.0
• 申請日: 2014-08-13
• 公開（公告）號: CN105200005A
• 公開（公告）日: 2015-12-30
• 發明（設計）人: 鄭媛;彭麗敏;尤鋒;譚訓剛;焦爽
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及海水魚類細胞培養技術，具體說是一種牙鲆肌衛星細胞系的構建方法及其鑒定牙鲆肌衛星細胞標記基因的特異性引物和應用。

背景技術

肌衛星細胞是一種起源于胚胎中胚層的肌源性干細胞，它的激活、增殖和分化是骨骼肌細胞增大、數目增多及肌纖維轉化的重要基礎。骨骼肌是魚肉組成的主要成分，水產養殖的效益源于魚類骨骼肌的快速增長，故骨骼肌生長和正常發育對于魚類養殖發展是很重要的。肌衛星細胞的體外培養是了解骨骼肌細胞增殖、分化和再生機理的重要手段和技術，可以籍此研究和了解魚類肌纖維發生分化與相關功能基因時空表達的內在聯系以及相關調節因子的作用機制，從而促進魚類肌肉速生快長；魚類肌衛星的更新和激活分子機理研究，也有助于獲得促進魚類肌肉生長的新的技術方法。但與其他脊椎動物相比，有關魚類肌肉衛星細胞研究甚少，尤其是經濟魚類的肌肉衛星細胞系及相關研究幾乎未見報道。牙鲆(Paralichthysolivaceus)俗稱牙片魚、偏口魚、比目魚，隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰈形目、鰈亞目、牙鲆科、牙鲆屬。其肉質鮮嫩，是一種名貴的海水經濟魚類，也是日本、韓國以及我國的重要海水增養殖魚類之一。體外分離培養得到的牙鲆肌衛星細胞將成為研究牙鲆肌肉分化途徑及性狀改良分子機制的重要研究平臺。

迄今，見諸報道的僅有大鼠、兔、豬、雞等非魚類的肌衛星細胞分離培養方法，其操作繁瑣、容易污染，且在保持肌衛星細胞較長時間的生存和增殖能力方面存在不確定性，也不太適合魚類肌衛星細胞培養。

發明內容

本發明的目的在于提供一種操作簡便的牙鲆肌衛星細胞系的構建方法及其鑒定牙鲆肌衛星細胞標記基因的特異性引物和應用。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種牙鲆肌衛星細胞系建立方法，將牙鲆肌肉組織經原代培養和傳代培養，繼而構建細胞系；

其中，原代培養，將0.5-1g靠近尾部的骨骼肌肉組織塊充分剪碎后加入到細胞培養液中懸浮，而后將肌肉組織塊懸液于25±0.2℃下正置培養，待組織塊完成貼壁后再補加0.5-1mL細胞培養液；

傳代培養，待上述經原代培養的組織塊周圍細胞遷出并增殖至形成巢式細胞暈時，加入0.25％胰蛋白酶消化液使細胞懸起得細胞懸液，而后利用細胞培養液進行原瓶傳代培養,待原瓶傳代細胞長滿瓶底后，將其用0.25％胰蛋白酶消化液消化懸起后細胞懸液與新鮮細胞培養液按1：1-1：2(v/v)的比例分瓶傳代，以后7天傳代一次，15代后每3-5天傳代一次，進而細胞系建立成功。

所述細胞培養液為在MEM培養液中加入占細胞培養液總體積20％的胎牛血清，10ng/mL人堿性成纖維生長因子，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，pH值為7.0-7.4，于4℃下保存，備用。

所述牙鲆可以由其它海水或淡水魚類所替換。進一步的說是半滑舌鰨、大菱鲆或圓斑星鰈。

所述骨骼肌肉組織塊為將牙鲆骨骼肌組織置于細胞培養液中3-5min后，吸出培養液，用1.0-1.2mLPBS(pH7.2)反復沖洗骨骼肌組織，再吸出PBS，將肌肉組織剪成小塊，待用。所述肌肉組織為約1mm³大小的小塊。

所述原代培養組織塊周圍細胞遷出并增殖至形成巢式細胞暈時，吸出培養液，用PBS(pH7.2)沖洗，吸出PBS，加入0.25％胰蛋白酶液消化，而后顯微鏡下觀察到細胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續在顯微鏡下觀察，待細胞變圓，在原瓶中加入細胞培養液使細胞懸浮，而后將懸液進行傳代。

一種用于鑒定牙鲆肌衛星細胞標記基因的特異性引物，用于鑒定魚類肌衛星細胞標記基因的特異性引物為，正向引物(F)TACTAGTGCTCGCCTGACATG；反向引物(R)TCAATCCTTAAACAATGCTGG。所述魚類為牙鲆。

一種用于鑒定牙鲆肌衛星細胞標記基因的特異性引物的應用，所述特異性引物用于制備定性和/定量檢測牙鲆肌衛星細胞標記基因的試劑盒。

本發明所具有的優點和積極效果如下：

1.本發明構建方式所涉及組織塊培養法不僅能克服因兩步酶消化法引起的細胞完整性破壞而導致的細胞功能紊亂和大量成肌細胞被消化的弊端，且其操作簡便，更適宜鲆鰈類甚至于其他海水、淡水魚類的肌衛星細胞培養。