[發明專利]一種具有低溫活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因

有效

• 申請號: 201410394792.5
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104152428B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 周峻沛;張蕊;黃遵錫;唐湘華;李俊俊;許波;丁俊美;高雅潔
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N15/81;C12N15/74;C12N1/21;C12N1/19;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 裴娜

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及的是一種具有低溫活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因、重組載體和重組菌。

背景技術

植物半纖維素約占植物干重的35％，是在自然界中僅次于纖維素的第二大類可再生的生物質能。甘露聚糖是自然界中半纖維素的第二大組分，由吡喃甘露糖以β-1,4糖苷鍵連接而成，廣泛存在于植物中。

水產養殖原料中甘露聚糖可最高占非淀粉多糖的34％。非淀粉多糖是存在于飼料中的主要抗營養因子，不被消化道所降解，遇水形成膠態溶液，使食糜粘度增大，阻礙營養物質的消化吸收，降低動物的生產性能。

甘露聚糖酶(β-mannanase；endo-β-1,4-D-mannanase；EC?3.2.1.78)是一類能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露寡糖及甘露聚糖的內切糖苷水解酶，降解產物為甘露糖和/或甘露寡糖。根據氨基酸序列同源性，甘露聚糖酶主要歸類于糖苷水解酶第5和26家族，其可來源于細菌、放線菌及真菌等。

甘露聚糖酶已在飼料、造紙、食品、制藥、紡織印染及石油開采等領域得到了廣泛的應用。在飼料中，外源甘露聚糖酶的添加可降解飼料中的甘露聚糖，從而起到積極的作用，如降低食糜粘性并提高飼料轉化率、破壞植物細胞壁結構以改善飼料營養價值、提高動物機體的免疫功能從而減少抗生素等化學藥物的使用、水解產物甘露寡糖可作為營養物質促進雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌的增殖。

具有低溫活性的甘露聚糖酶制劑可應用于低溫生境和低溫加工過程，如水產飼料中應用的甘露聚糖酶需要在低溫(10–20℃)環境下具有催化活性。目前，已報導2個具有低溫活性的甘露聚糖酶(專利號：ZL201110326253.4及專利申請號：201310539350.0)。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供了一種具有低溫活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因、重組載體和重組菌。

本發明的技術方案如下：

一種具有低溫活性的甘露聚糖酶ManAGN25，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

一種編碼所述的甘露聚糖酶ManAGN25的甘露聚糖酶基因manAGN25，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述的甘露聚糖酶基因manAGN25的重組載體是包含有甘露聚糖酶基因manAGN25的重組載體。

所述的甘露聚糖酶基因manAGN25的重組菌是包含有甘露聚糖酶基因manAGN25的重組菌。

所述重組菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌中的一種。

所述甘露聚糖酶ManAGN25總共含371個氨基酸，理論分子量為42.2kDa。ManAGN25的N端28個氨基酸為預測的信號肽序列“MRKTKIKRYLGQLILCGTFALAAFSLRA”，成熟的甘露聚糖酶ManAGN25含343個氨基酸。經BLAST比對，甘露聚糖酶ManAGN25與GenBank中Sphingobacterium?sp.IITKGP-BTPF85來源的假定蛋白(hypothetical?protein)(序列號：EQB79541)具有最高的一致性，為70.9％，該假定蛋白功能還未研究，只是通過序列相似性歸類于糖苷水解酶第26家族蛋白；ManAGN25與已驗證功能的Sphingomonas?sp.JB13來源甘露聚糖酶(AFE82293)的一致性為38.0％。以上BLAST比對結果說明該甘露聚糖酶ManAGN25是一種新的甘露聚糖酶。

本發明通過PCR的方法分離克隆了甘露聚糖酶ManAGN25的編碼基因manAGN25，其全長1116bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TAA。

本發明提供了一個新的甘露聚糖酶基因manAGN25，其編碼的甘露聚糖酶ManAGN25的最適pH為6.5–7.0；最適溫度為35–40℃，在10℃和20℃下分別具有約15％和約45％的酶活；經0.1MpH5.0–8.0緩沖液在37℃下處理60min，仍能保持60％以上的活性；37℃時半衰期約為60min。本發明的甘露聚糖酶ManAGN25為低溫甘露聚糖酶，可應用于水產飼料及食品行業中。

附圖說明

圖1為在大腸桿菌中表達的重組甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析；其中，M：低分子量蛋白質Marker；1：純化的重組甘露聚糖酶。

圖2為純化的重組甘露聚糖酶的pH活性。