[發明專利]一種結核桿菌LAMP法恒溫快速檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201410394614.2
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN105274193A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 張波;羅力涵;陳鈺;李莎;畢秀欣;王嬙
• 申請（專利權）人: 沈陽國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

1.一種結核桿菌LAMP法恒溫快速檢測試劑盒，其特征在于包括如下組分：反應混合液、引物混合液、雙蒸水、BstDNA聚合酶、陽性對照模板、顯色液、封閉劑；

所述反應混合液的組分及濃度為：40mMTris-HCl(pH8.8)，20mMKCl,20mM(NH₄)₂SO₄，體積百分比0.2％的TritonX-100，1.6M甜菜堿,16mMMgSO₄,2.8mMdNTP；

所述引物混合液的組分為：內引物FIP和BIP各80pmol,，外引物F3和B3各10pmol，環引物LB和LF各40pmol；

所述BstDNA聚合酶為：8UBstDNA聚合酶；

所述陽性對照模板根據下列結核分枝桿菌基因靶序列合成的人工質粒；結核桿菌的靶序列為：

TCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACCGTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCGTCCAGCGCCG；

所述顯色液為：鈣黃綠素。

2.根據權利要求1所述的一種結核桿菌LAMP法恒溫快速檢測試劑盒，其特征在于所述引物包括內引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環引物LB、LF，其LAMP引物擴增靶基因為：

TB-159F3:TCCACGCCGCCAACT

TB-159B3:CGGCGCTGGACGAGAT

TB-159FIP:TCTGGCCACCTCGATGCCCTTTTCGGTGTTTACGGTGCCCG

TB-159BIP:ACGGCTGATGACCAAACTCGGCTTTTGGCTGTGGCCGGATCA

TB-159LF:TTCAGGGTTAGCCACACTTTG

TB-159LB:CAAAGCCCGCAGGACCA。

3.根據權利要求1所述的一種結核桿菌LAMP法恒溫快速檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒所述試劑盒在-20℃保存。

4.一種結核桿菌LAMP法恒溫快速檢測方法，采用上述結核桿菌LAMP法恒溫快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于按照以下步驟進行：

(1)模板制備：

(2)加樣：取出一個0.2EP管按下面的量以及順序進行加樣：反應混合液12.5μl、引物混合液2.6μl、雙蒸水6.9μl、BstDNA聚合酶1μl、陽性對照模板或樣本DNA2μl、顯色液1μl、封閉劑一個；總反應體系為26μl；

(3)等溫擴增：將上述樣品混勻，置于65℃保溫50min，冷卻至室溫；觀察顏色變化；

(4)陰陽性判斷：綠色表示待測樣品中存在結核桿菌(陽性)，橙色表示待測樣品中不存在結核桿菌(陰性)。

5.根據權利要求4所述的一種結核桿菌LAMP法恒溫快速檢測方法，其特征在于步驟(1)模板制備按照以下步驟進行：

1)TritonX-100裂解液制備：10mmol/LTris-HCL，0.1mmol/LEDTA(PH＝8)，體積百分比1.0％的TritonX-100；

2)DNA提取：取100μl菌懸液，加入TritonX-100裂解液200μl混勻，煮沸30min；然后12000r/min離心15min，取上清液做模板備用。