[發(fā)明專利]重組腈水解酶、編碼基因、突變體、工程菌及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410394471.5
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104212784B
• 公開（公告）日: 2017-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭裕國;柳志強(qiáng);張新紅;薛亞平;徐喆;賈東旭;沈寅初
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種腈水解酶，特別涉及一種重組腈水解酶、編碼基因、突變體、工程菌及應(yīng)用，以及表達(dá)腈水解酶的重組大腸桿菌生物催化1-氰基環(huán)己基乙腈制備加巴噴丁關(guān)鍵中間體1-氰基環(huán)己基乙酸的方法。

(二)背景技術(shù)

加巴噴丁化學(xué)名為1-氨甲基-1-環(huán)己烷乙酸。由美國Warner-Lambert公司開發(fā)，于1993年5月首先在英國上市，1994年獲得FDA批準(zhǔn)在美國上市，后來陸續(xù)在全世界眾多國家被用于癲癇病治療，1996年，Warner-Lambert公司開始擴(kuò)大加巴噴丁適應(yīng)癥的研究，2002年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)將其用于治療神經(jīng)病理性疼痛藥。加巴噴丁除可單獨(dú)用于治療一般癲痛病外，還被作為難治性癲癇病的疊加治療藥，它具有耐受性良好，副作用輕微的優(yōu)點(diǎn)，是人們期待的推動世界癲癇藥物市場發(fā)展的藥物之一。目前，加巴噴丁的專利已經(jīng)到期，世界各國紛紛開展對于該產(chǎn)品的研究，原料藥需求巨大，市場前景廣闊。

目前，加巴噴丁主要通過化學(xué)法合成，合成路線較多，主要列舉以下3種：

(1)以環(huán)己酮為原料，經(jīng)過環(huán)合、水解制得1,1-環(huán)己基-二乙酸，然后通過縮合、氨解得到1,1-環(huán)己基-二乙酸單酰胺，經(jīng)過Hofmann降解反應(yīng)，產(chǎn)物通過萃取、離子交換層析、重結(jié)晶得到加巴噴丁純品(WO2003002504A，2003；WO2003002517A，2003；US2004063997Al，2004)。

(2)以環(huán)已酮為原料，與乙腈經(jīng)過Knoevenagel反應(yīng)得烯腈，與硝基甲烷經(jīng)Michael加成反應(yīng)得到1-硝甲基-環(huán)己基乙腈。隨后經(jīng)過Pd-C催化氫化還原、水解、RaneyNi催化氫化還原得到2-氮雜-螺[4,5]-3-癸酮，其水解得到加巴噴丁鹽酸鹽，精制得加巴噴丁純品(US2003009055A，2003)。

(3)由環(huán)己酮合成的1-氰基環(huán)己基乙腈為原料，在甲苯、醇溶液中，通入干燥HCl加壓反應(yīng)，并去除過量的HCl和溶劑，調(diào)pH，水洗，蒸除溶劑得到1-氰基環(huán)己基乙酸乙酯。1-氰基環(huán)己基乙酸乙酯在堿性條件下加熱反應(yīng)，以RaneyNi為催化劑進(jìn)行催化加氫，冰乙酸調(diào)pH至中性，析出加巴噴丁粗品，經(jīng)甲醇、水、異丙醇重結(jié)晶得加巴噴丁精品。(EP4l4262A，1991)，此方法雖然可以跳過加巴噴丁鹽酸鹽，省去了復(fù)雜的加巴噴丁提純工藝，但是化學(xué)法腈水解(醇解)，反應(yīng)中需要使用大量(例如：10倍量的芐醇/乙醇)的相對較貴的原料，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)生的廢氣須大量堿液吸收，步驟較多，收率較低。

腈水解酶能夠?qū)崿F(xiàn)有機(jī)腈化合物的一步水解合成對應(yīng)的有機(jī)羧酸。通過腈水解酶實(shí)現(xiàn)氰基水解反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)效率高，而且具有比較高的區(qū)域選擇性和立體選擇性。近年來，利用腈水解酶進(jìn)行氰基水解合成有機(jī)羧酸已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，大量文獻(xiàn)、專利報道了腈水解酶在有機(jī)羧酸合成中的應(yīng)用。更重要的是，許多對于雙腈具有區(qū)域選擇性催化活力的腈水解酶的發(fā)現(xiàn)，對于阿托伐他汀側(cè)鏈關(guān)鍵手性中間體(R)-4-氰基-3-羥基丁酸(Junhua Tao,Org.Process.Res.Dev.2006,10,661-665)、普瑞巴林手性中間體(3S)-3-氰基-5-甲基己酸(Zhiyi Xie,J.Mol.Catal.B-Enzym.2006,41,75-80)、加巴噴丁中間體1-氰基環(huán)己基乙酸(US2005009157 A1)、L-甲基多巴等關(guān)鍵藥物中間體酶法合成工藝的建立具有巨大的指導(dǎo)作用。因此，獲得對1-氰基環(huán)己基乙腈具有高水解活性和區(qū)域選擇性的腈水解酶，有利于實(shí)現(xiàn)加巴噴丁的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

1-氰基環(huán)己基乙酸是非常重要的醫(yī)藥中間體，是新一代抗癲癇來藥物加巴噴丁的合成前體。區(qū)域選擇性腈水解酶催化生產(chǎn)1-氰基環(huán)己基乙酸不僅相比傳統(tǒng)的化學(xué)法縮短了步驟，而且綠色、高效。篩選新型生物催化劑，開發(fā)高效加巴噴丁關(guān)鍵中間體酶法合成工藝，建立綠色經(jīng)濟(jì)的加巴噴丁合成新工藝具有重要意義。Zhu等人(Dunming Zhu,Adv.Synth.Catal.2007,349,1667-1670)報道了來自于菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110中的腈水解酶bll6402，發(fā)現(xiàn)此腈水解酶可以催化各種雙腈，對部分雙腈具有較高的區(qū)域選擇性，然而，由于較低的催化活性和底物耐受性抑制了1-氰基環(huán)己基乙酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是解決傳統(tǒng)的化學(xué)法水解1-氰基環(huán)己基乙腈為1-氰基環(huán)己基乙酸的工藝中，反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)中需要大量的有機(jī)溶劑，成本較高，收率較低，環(huán)境污染較為嚴(yán)重的問題。