[發明專利]山羊痘病毒Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201410394039.6
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104152583A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 王昱;聶福平;楊俊;王國民;李應國
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

1.山羊痘病毒Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物及探針，其特征在于：包括山羊痘病毒上游引物，其DNA序列為SEQ?ID?NO.1;

山羊痘病毒下游引物，其DNA序列為SEQ?ID?NO.2；

山羊痘病毒MGB探針，其DNA序列為SEQ?ID?NO.3。

2.山羊痘病毒Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于：包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中：

所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成：

DNA序列為SEQ?ID?NO.1的10μmol/L的山羊痘病毒上游引物2.0μL；

DNA序列為SEQ?ID?NO.2的10μmol/L的山羊痘病毒下游引物2.0μL；

DNA序列為SEQ?ID?NO.3的10μmol/L的山羊痘病毒MGB探針1.4μL；

2×Premix?Ex?Taq緩沖液?8μL；

滅菌去離子水?5.6μL；

合計19μL，為單次反應的用量；

所述陽性對照管，管內為山羊痘病毒陽性重組質粒DNA，體積為20μL；

所述陰性對照管，管內為無山羊痘病毒感染的羊組織基因組DNA，體積為20μL；

所述滅菌去離子水管?1mL～2mL。

3.根據權利要求2所述山羊痘病毒Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于：所述陽性重組質粒DNA由如下反應獲得：

核苷酸序列為SEQ?ID?NO.4的PCR上游引物和核苷酸序列為SEQ?ID?NO.5的PCR下游引物按常規方法進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD19-T載體進行連接反應獲得所述陽性重組質粒DNA。

4.根據權利要求2所述山羊痘病毒Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于：所述DNA序列為SEQ?ID?NO.3的山羊痘病毒MGB探針的5^，端標記有報告基團FAM，3^，端標記有非淬滅基團，同時還連接有MGB修飾基團。

5.利用權利要求2所述試劑盒進行山羊痘病毒Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法：包括如下步驟：

1）制備待檢模板DNA：選用商品化的細胞培養液DNA提取試劑盒，提取待測樣品中DNA，獲得待檢模板DNA；

2）擴增反應體系為：19μL擴增反應液；1μL待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20μL;

3）山羊痘病毒熒光定量PCR擴增：將步驟2）配制好的擴增反應體系進行PCR擴增，反應條件：預變性95℃?30s；95℃?5s，60℃?34s?40個循環；在60℃?34s進行熒光信號的采集；

4）結果判定：將擴增反應在35個循環以內且擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。