[發(fā)明專(zhuān)利]側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1及其編碼基因和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410392400.1
• 申請(qǐng)日: 2014-08-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104151404A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭立華;邱德文;楊秀芬;曾洪梅;袁京京;王顥潛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/195
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/195;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;A01H5/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

本發(fā)明所述的側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus?laterosporus)A60菌株是本實(shí)驗(yàn)室從海南昌江土壤中分離出的高活性生防菌株，已經(jīng)于2012年1月9日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC?No：5694。本實(shí)驗(yàn)室已成功從A60代謝產(chǎn)物中分離得到一種新型抗菌肽BL-A60。近年來(lái)應(yīng)用生防細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)出來(lái)的生防制劑越來(lái)越受到人們的關(guān)注。生防細(xì)菌誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性通常具有廣譜性、系統(tǒng)性和非特異性，為多途徑利用植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性防治植物病害開(kāi)辟了廣闊前景。已有報(bào)道從生防細(xì)菌中篩出可引起植物系統(tǒng)抗性的激發(fā)子。但是目前在側(cè)孢短芽孢桿菌中并沒(méi)有相關(guān)發(fā)現(xiàn)，所以從A60菌株中尋找一種新的蛋白質(zhì)激發(fā)子是非常必要的，并且可以完善和豐富A60菌株及其代謝產(chǎn)物的生物防治功能，拓展其應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高植物抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的側(cè)孢短芽孢桿菌分泌蛋白質(zhì)PeBL1及其基因序列和該蛋白及其基因的應(yīng)用。

一種側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示。

本發(fā)明所述的側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1在提高植物系統(tǒng)抗性和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中所述植物為本生煙。

一種多核苷酸，其核苷酸序列為下列所述之一：

(1)編碼序列表中SEQ?ID?NO:2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列；

(2)與(1)中多核苷酸序列根據(jù)堿基配對(duì)原則互補(bǔ)的多核苷酸序列。

本發(fā)明所述的多核苷酸，其中，編碼序列表中SEQ?ID?NO:2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。

一種重組載體，含有本發(fā)明所述的多核苷酸。

本發(fā)明所述的重組載體，其中所述載體為在pET30載體多克隆位點(diǎn)插入本發(fā)明所述的多核苷酸的重組載體。

一種遺傳工程的宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明所述的重組載體。

本發(fā)明所述的遺傳工程的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為含有本發(fā)明所述的重組載體的大腸桿菌BL21(DE3)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)，是指來(lái)自側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus?laterosporus)A60的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液的上清液或菌體的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：

本發(fā)明側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1蛋白質(zhì)可以明顯的提高植物的抗性，10μMHis-PeBL1處理本生煙葉3d后接種TMV-GFP，對(duì)病斑數(shù)及病斑直徑的最高抑制率可分別達(dá)到42.91％和43.23％。對(duì)假單胞桿菌(Pseudomonas?syringae)的抑制率達(dá)到了29.01％。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的側(cè)孢短芽孢桿菌A60激發(fā)子PeBL1蛋白質(zhì)及其編碼基因和應(yīng)用作進(jìn)一步說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中粗蛋白通過(guò)陽(yáng)離子交換柱HiTrap?SP?FF的色譜圖；實(shí)線為吸收值，虛線為洗脫液的百分含量；A、B、C代表三個(gè)洗脫峰；

圖2為本發(fā)明中利用Agilent?1200HPLC高效液相色譜對(duì)洗脫峰B進(jìn)行反相柱層析的譜圖；B1、B2、B3、B4、B5代表五個(gè)洗脫峰；

圖3為本發(fā)明中利用Agilent?1200HPLC高效液相色譜對(duì)有活性的洗脫峰B5進(jìn)行純度檢測(cè)的譜圖；

圖4為本發(fā)明中洗脫峰B與B5跑tricine-sds-page圖譜；M代表Marker；

圖5為本發(fā)明中在煙草上對(duì)不同濃度的His-PeBL1(10μM，5μM，2.5μM，1μM，0.1μM，0.01μM)進(jìn)行活性監(jiān)測(cè)的結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明中分別經(jīng)過(guò)His-PeBL1(實(shí)線)和緩沖液(虛線)處理的煙草懸浮細(xì)胞活性氧物質(zhì)的定量檢測(cè)圖；縱坐標(biāo)為發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)，發(fā)光強(qiáng)度越高說(shuō)明產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)越多，橫坐標(biāo)代表處理時(shí)間。

圖7為分別經(jīng)過(guò)His-PeBL1和緩沖液(對(duì)照)處理的煙草葉片活性氧物質(zhì)的定性檢測(cè)圖；左部分為對(duì)照，右部分為處理；

圖8為分別經(jīng)過(guò)His-PeBL1(實(shí)線)和緩沖液(虛線)處理的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基堿化情況圖；