[發明專利]鹿牛羊馬驢豬動物皮組織DNA的PCR鑒定用引物體系

在審

• 申請號: 201410389101.2
• 申請日: 2014-08-08
• 公開（公告）號: CN104152558A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 黨平;宋平;王瑜;杜雨威
• 申請（專利權）人: 蘇州紅冠莊國藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 昆山四方專利事務所 32212
• 代理人: 盛建德

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及鹿、牛、羊、馬、驢和豬動物皮組織DNA的PCR鑒定用引物體系及PCR鑒定方法，以及相應的試劑盒，適用于上述六種動物皮組織及其制品的快速檢測及鑒定，尤其適用于鹿皮及鹿皮膠的快速防偽鑒定。

背景技術

鹿皮是我國的傳統中藥，藥用歷史悠久。早在《本草綱目》中就有鹿皮“補氣，澀精，斂瘡”功效的記載；《四川中藥志》中也記載了其“能補氣，澀虛滑，治婦女白帶，血崩不止，腎虛滑精，涂一切瘡”。以梅花鹿或馬鹿的皮為原料加工精制而成的鹿皮膠富含多種氨基酸與微量元素，具有補血止血、補腎壯陽等多種營養保健作用。《北京市中藥炮制規范》描述鹿皮膠味咸，性溫，歸肝，腎經，主治補氣，澀虛精，強筋健骨，可用于身體瘦弱，腰酸耳鳴，頭暈目眩，虛弱久咳，痰中帶血，虛喘氣短，婦女經血不調，崩漏帶下，性偏于溫，既能補陽，又可滋陰補血、止血。

利用現代技術測定鹿皮膠成分[張瀟予，徐厚平，劉代成，鹿皮膠的成分分析，山東師范大學學報，2010，25(4)]，發現其中包括8種必需氨基酸，包括賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸，均為人類不能自身合成的必需氨基酸，對于身體發育、新陳代謝都具有重要作用。將鹿皮膠的氨基酸組成與阿膠(即驢皮膠)進行對比，結果顯示二者基本一致。這些都說明鹿皮膠與阿膠一樣，具有很大的藥用保健價值及市場價值。然而對鹿皮產品完整的科學數據，特別是特型鑒定方面的數據尚無處可查，尤其是當鹿皮、驢皮等原材料制成皮膠產品后單單利用傳統目測及理化分析并不能很有效地判別這些性質十分相似的皮膠樣品。

在這種情況下，利用高科技的技術建立分子生物學鑒定手段，能夠為人們提供經現代科學技術鑒定的高質量鹿皮及鹿皮膠產品。現代分子生物學技術具有可靠、靈敏、快速的特點，尤其是對于干燥、加熱、蒸煮等處理過的樣品仍舊能保持檢測的準確性。利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術可以從微量DNA樣品中靈敏地擴增出特定的DNA片段，并且通過引物序列的差異來有效保證反應的特異性。因此PCR技術被廣泛應用于物種鑒定、檢測等領域，在防止假冒、摻假、保證產品質量、維護消費者權益方面發揮了巨大的作用。

本公司公開號為CN103424546A的中國專利公開了鹿皮膠中所含鹿皮膠特異DNA序列的PCR擴增實驗鑒定。目前國內外尚無鹿皮及鹿皮膠PCR鑒定的其他專利/文獻可循。另外，對于多個常見物種(包括牛羊馬驢豬等)動物皮組織DNA的PCR同步鑒定方法尚沒有建立，例如公開號為CN102747167?A的中國專利采用PCR的方法用于鑒定阿膠，就只是區分了驢皮及馬皮/騾皮。這樣容易造成物種的漏檢，不能有效防止假冒、摻假現象。因此，建立鹿及常見物種動物皮組織DNA的PCR鑒定方法十分必要。

本公司前期申請的發明專利(CN102876805?B)建立了鹿及豬牛羊馬驢兔雞常見物種動物血液DNA的PCR鑒定技術。但是由于皮膚組織與血液的DNA組成差別巨大，血液中占絕大比例的紅細胞不含基因組DNA，僅白細胞含有少量基因組DNA；而皮膚組織中基因組DNA占絕大比例，因此DNA成分更為復雜，極易對PCR結果造成干擾。實驗檢測中也證實了非特異性干擾的存在。因此本發明在前述發明的基礎上，針對鹿及牛羊馬驢豬常見物種動物皮組織DNA的PCR條件進行了優化，并且對馬、豬兩個物種的鑒定引物進行了重新設計及有效性驗證。

發明內容

為了克服上述現有技術中存在的不足，本發明提供了一種鹿牛羊馬驢豬動物皮組織DNA的PCR鑒定用引物體系，該引物體系及基于該引物體系進行的鑒定方法可快速且高特異性的檢測鹿牛羊馬驢豬動物皮制品的真偽及其是否有摻假，尤其適用于鹿皮和鹿皮膠產品鑒定與檢測，其對常見物種的檢測覆蓋面廣泛，可信度高。

本發明為了解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種鹿牛羊馬驢豬動物皮組織DNA的PCR鑒定用引物，由下列引物對組成：

(1)對鹿12S?rRNA基因進行擴增生成鹿特異性擴增片段的引物對Ⅰ：

正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’

反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’；

(2)對牛Cytb基因進行擴增生成牛特異性擴增片段的引物對Ⅱ：

正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’

反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’；

(3)對羊Cytb基因進行擴增生成羊特異性擴增片段的引物對Ⅲ：