[發明專利]一種靈菌紅素的分離純化方法

有效

• 申請號: 201410387848.4
• 申請日: 2014-08-08
• 公開（公告）號: CN104193665A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 張春穎;楊旭錦
• 申請（專利權）人: 西藏天虹科技股份有限責任公司
• 主分類號: C07D207/44
• 分類號: C07D207/44
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，涉及一種直接從發酵液中分離純化靈菌紅素的方法。

背景技術

靈菌紅素(prodigiosins，PG)是一類具有多個吡咯環結構的天然紅色素，分子式為C₂₀H₂₅N₃O(M＝323.1968)，其結構式見附圖1。

靈菌紅素1929年由Amak等研究發現，由Harashiniak等首次分離并純化鑒定出來。靈菌紅素早期的研究主要集中在該色素具有抗菌、抗真菌、抗癥疾、和其他生物活性，現在研究最熱門的表現在其免疫抑制活性和抗腫瘤輔助作用上，這種天然的抗癌藥物，己越來越受到研究界的廣大關注并有待成為抗癌藥的待選藥物。近些年關于靈菌紅素的研究還包括其在食品和工業領域的應用價值。

早在20世紀早期，就有科學家描述了靈菌紅素化學合成的全過程，但比較復雜和困難。隨后有新研究提出了新的制備靈菌紅素類似物的方案得到靈菌紅素前體物質，步驟簡單，合成效率明顯提高，但無法得到天然的十二烷基靈菌紅素。利用化學合成法大量制備靈菌紅素一直未能實施，研究人員將目光轉向了微生物發酵生產。靈菌紅素可由多種細菌和放線菌產生，包括鏈霉菌屬(Streptomyces)、沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，其中關于沙雷氏菌屬(Serratia)的研究最多。

靈菌紅素是細胞壁的組成部分，在Serratia發酵生產靈菌紅素的過程中，產生的靈菌紅素大部分附著在細菌的內外膜上，只有少部分呈游離狀態存在于發酵液中，通過加入表面活性劑可將靈菌紅素釋放到溶液中，從而增加游離態靈菌紅素的比例，而細胞膜的完整性對于靈菌紅素的生物合成是必需的。基于此，靈菌紅素的分離純化過程主要采取發酵結束后離心取菌體，然后用酸性甲醇萃取的方法，萃取液再經過硅膠柱和反向柱分離純化得到靈菌紅素純品。此技術是目前靈菌紅素分離純化的主要方法，該工藝有機溶劑耗量大，產品收率低，很難滿足批量生產的需要。

為了克服以上技術難題，本發明提供一種靈菌紅素的分離純化方法。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術缺陷，提供一種靈菌紅素的分離純化方法，為規模化生產提供依據。與現有技術相比，本發明提取收率高、化學試劑用量少、用時短和產品純度高。

本發明的技術方案是：一種靈菌紅素的分離純化方法，包括以下步驟：

步驟一、取靈菌紅素發酵液離心，收集菌體，溶解；

步驟二、將步驟一中的溶液進行超聲波提取，提取時間為20～30min，溫度為25～28℃，頻率為30～45kHz，離心，真空濃縮；

步驟三、將所得濃縮物加入乙酸乙酯溶解，密封振蕩，離心，收集上清液；

步驟四、將所述上清液進行硅膠柱層析，收集洗脫組分；

步驟五、將所述洗脫組分經常壓蒸發濃縮去乙酸乙酯等溶劑，將濃縮液烘干，得到精制靈菌紅素。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟四中，硅膠柱層析法進行梯度洗脫的流動相為石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，梯度洗脫的條件為起始階段石油醚和乙酸乙酯體積比為60∶1，中間階段石油醚和乙酸乙酯體積比為50∶1和20∶1，最終階段石油醚和乙酸乙酯體積比為4∶1，收集最終階段洗脫下來的組分。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟四中，所述硅膠柱層析法的載體為200目硅膠層析柱。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟一中，靈菌紅素發酵液在轉速為10000rpm下進行離心，離心時間為10～15min。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟一中，收集菌體后，加入丙酮溶解所述菌體，所述菌體與丙酮的體積比為1∶3～1∶2。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟二中，超聲波提取液在轉速為10000rpm下離心10～15min。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟三中，乙酸乙酯與濃縮物的體積比為10∶1～15∶1，密封之后，在溫度為30℃下，轉速為200rpm振蕩2～3天。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟三中，將振蕩后的溶液在轉速為10000rpm下進行離心，離心時間為10min。

優選的是，所述的靈菌紅素的分離純化方法中，所述步驟五中，精制得到的靈菌紅素純度不低于98.5％。

本發明的優點在于：