[發明專利]一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2′?脫氧腺苷的方法

有效

• 申請號: 201410387566.4
• 申請日: 2014-08-08
• 公開（公告）號: CN104178541B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 張春穎;楊旭錦
• 申請（專利權）人: 西藏天虹科技股份有限責任公司
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C07H19/173;C07H1/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 史霞

1.一種利用大腸埃希氏菌轉化生產2′-脫氧腺苷的方法，其特征在于，

將具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌接種產酶培養基進行發酵培養，將發酵培養得到的大腸埃希氏菌菌體作為催化反應的酶源與脫氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及緩沖液按照一定的比例混合組成反應混合物，并于溫度50-55℃下進行轉化反應1-2h，得到含有所述2′-脫氧腺苷的生物轉化液；

此外，還包括以下步驟：

步驟一、堿基去除，將所得生物轉化液離心，得到去除大腸埃希氏菌菌體的上清液，調節所得上清液的pH值為6.5-7.0后冷卻靜置15-18h，去除所析出固體物質得到去除堿基的生物轉化液；

步驟二、結晶，調節所述去除堿基的生物轉化液的pH值至10-11后冷卻靜置6-8h，分離所析出的固體物質得2′-脫氧腺苷粗品；

步驟三、重結晶，以30％乙醇溶液為溶劑，在60℃溫度下將所得2′-脫氧腺苷粗品進行溶解，溶解過程中不斷攪拌，直至2′-脫氧腺苷粗品不再溶解即制成2′-脫氧腺苷的乙醇飽和溶液，冷卻至4℃靜置6-8h，2′-脫氧腺苷重結晶，得到純度為99.52％的所述2′-脫氧腺苷純品；

其中，所述反應混合物中的緩沖液為濃度為45-50mmol/L，pH值為6.5-7.0的磷酸鹽緩沖液；構成所述反應混合物的各組分的配比為：脫氧胸腺嘧啶核苷3-5mmol，腺嘌呤3-5mmol，大腸埃希氏菌菌體4-10g及磷酸鹽緩沖液100mL；

所述大腸埃希氏菌為保藏編號是CGMCC No.8089的大腸埃希氏菌TH-1；

所述大腸埃希氏菌的發酵培養方法為：

A、種子培養，挑取具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌種接種于液體種子培養基中，于37℃搖床上培養40h，得到種子培養液，所述種子培養基組成為：酵母膏8.2g，蛋白胨14.1g，NaCl 7.3g及蒸餾水1000mL,121℃滅菌20min，pH值7.3；

B、發酵培養，將種子培養液按照產酶培養基體積的7％的接種量接種于所述產酶培養基進行發酵培養，發酵培養溫度為37℃，發酵培養時間10h，得到含有大腸埃希氏菌菌體的發酵培養液，產酶培養基組成為：牛肉膏12.6g，酵母膏13.8g，蛋白胨7.5g，NaCl 8.5g及蒸餾水1000mL,121℃滅菌20min，pH值7.5。

2.如權利要求1所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2′-脫氧腺苷的方法，其特征在于，所述大腸埃希氏菌菌體的制備方法為：將所述發酵培養液在3-4℃條件下5000-10000rpm離心5-10min，收集沉淀得到大腸埃希氏菌濕菌體，將所得大腸埃希氏菌濕菌體用pH值6.5-7.0，濃度為18-20mmol/L的磷酸鉀緩沖液洗滌2-3次后，再次離心即得所述大腸埃希氏菌菌體。

3.如權利要求1所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2′-脫氧腺苷的方法，其特征在于，步驟一中所述去除所析出的固體物質及步驟二和步驟三中分離析出的固體物質的方法均采用抽濾的方法；所述冷卻靜置的溫度均為3-4℃。

4.如權利要求3所述的利用大腸埃希氏菌轉化生產2′-脫氧腺苷的方法，其特征在于，離心所得大腸埃希氏菌菌體于-20℃冷凍保存備用。