[發明專利]一種快速檢測圓環病毒中具有細胞感染力病毒粒子含量的方法

在審

• 申請號: 201410385128.4
• 申請日: 2014-08-07
• 公開（公告）號: CN105331737A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發明（設計）人: 林華;陳世界;楊苗;肖艷;嚴玉寶;胡娟;趙姍;薛昌華
• 申請（專利權）人: 四川出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;成都大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種快速檢測具有細胞感染力的圓環病毒含量的方法，包括實時熒光PCR檢測豬圓環病毒含量的特異性引物、標準質粒的制備、樣品細胞吸附前處理、含量測定，其具體特征如下：

(1)、病毒標準質粒構建及檢測標準曲線建立

采用特異性引物，通過PCR擴增，獲得圓環病毒全基因片段，將目的片段連接到克隆載體上，轉化到感受態細胞，提取質粒DNA，獲得圓環病毒檢測用的標準質粒。將制備的標準質粒作10倍梯度稀釋，以稀釋液為模板，進行熒光定量PCR，采集熒光型號，繪制出實施熒光定量標準曲線，并獲得其產物Tm值。

(2)、細胞吸附

取一定量的待檢病毒與敏感細胞進行充分吸附，用緩沖液對細胞進行清洗，將未吸附上的病毒粒子從細胞上充分洗脫。

(3)、具有細胞感染力病毒粒子含量的測定

將病毒原液和吸附了病毒的細胞進行核酸提取，通過實時熒光PCR對吸附進細胞中的病毒的進行檢測，通過標準曲線進行相對定量。

2.根據權利要求1所述的特異性引物，其特征在于：引物PCV-Full-F和PCV-Full-R，能夠特異性擴增圓環病毒2型的基因組DNA，擴增產物大小為1774bp。

3.根據權利要求1所述的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：引物T-F、T-R和探針T-P，能夠特異性檢測PCV的核酸。

4.根據權利要求1所述的具有細胞感染力病毒粒子含量快速檢測方法，其特征在于：步驟B中，所述的吸附時間為10分鐘至12小時，緩沖液可以是生理鹽水、磷酸緩沖溶液(PBS)、hanks、D-Hanks、Earle、MEM、DMEM中的一種或多種，細胞清洗次數為1至10次。

5.根據權利要求1所述的具有細胞感染力病毒粒子含量快速檢測方法，其特征在于：通過檢測病毒原液中總病毒和吸附病毒后的細胞中病毒的含量，可以獲得病毒原液中具有感染力病毒粒子與總病毒粒子含量的比值。