[發(fā)明專利]一種重組畢赤酵母工程菌和代謝的重組木聚糖酶及其制備

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410383350.0
• 申請日: 2014-08-07
• 公開（公告）號: CN104130951A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳勇;張慧玲;李曉
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);陳勇
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/56;C12N15/81;C12N9/42;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種高表達木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm，該基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm菌種保藏編號為巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）CGMCC?No.?9398。

2.一種如權(quán)利要求1所述高表達木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm的基因序列，其特征在于，所述基因序列是一種源于人工合成編碼的瘤胃厭氧真菌Neocallimastix?frontalis木聚糖酶基因Xyn11B優(yōu)化的核苷酸序列Xyn11Bm，長度為1014bp，序列如SEQ?ID??NO：1所示。

3.一種能在畢赤酵母中高效表達的產(chǎn)木聚糖酶基因序列SEQ??ID??NO：1，此序列是在SEQ?ID??NO：2序列基礎(chǔ)上定點誘變而成，所編碼的氨基酸密碼子可以在巴斯德畢赤酵母中有效表達，該人工合成的DNA共編碼337個氨基酸殘基，氨基酸殘基排列順序如SEQ?ID?No.3?所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述優(yōu)化的Neocallimastix?frontalis木聚糖酶基因Xyn11Bm的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9K-Xyn11Bm。

5.一種優(yōu)化的Neocallimastix?frontalis木聚糖酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）根據(jù)酵母密碼子偏愛性對Xyn11B的密碼子進行初步替換；

（2）采用Oligo?6.0分析替換后基因序列中的限制性內(nèi)切酶切割位點，通過密碼子調(diào)整，消除基因序列中的Bgl?II、Sac?I、Sal?I、EcoR?I和Not?I的切割位點；

（3）采用BioEdit?7.0分析調(diào)整后基因序列中mRNA隱蔽剪接位點，并再次對密碼子進行調(diào)整，以消除其中的隱蔽剪接位點GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、PolyT和PolyA，并計算GC百分比，再根據(jù)GC百分比對密碼子最進一步調(diào)整，使其處于40-50%之間；

（4）采用RNA?Structure?3.2對mRNA二級結(jié)構(gòu)的自由能進行分析，篩選獲得自由能最低的基因序列SEQ?ID?No.?1，并命名為Xyn11Bm；

（5）采用全基因合成方法獲得SEQ?ID?No.?1所示核苷酸序列；

（6）構(gòu)建含有SEQ?ID?No.?1所示核苷酸序列的重組載體pPIC9K-Xyn11Bm；

（7）將重組載體pPIC9K-Xyn11Bm轉(zhuǎn)化宿主細胞GS115，獲得重組菌株并在酵母細胞中表達；

（8）純化所表達的木聚糖酶。

6.一種如權(quán)利要求5所述獲得Neocallimastix?frontalis木聚糖酶。

7.權(quán)利要求5?所述優(yōu)化的Neocallimastix?frontalis木聚糖酶用于非治療目的降解木聚糖的應(yīng)用。