[發明專利]應用于檢測菊科植物病毒病的抗體芯片和試劑盒及其方法

有效

• 申請號: 201410382666.8
• 申請日: 2014-08-06
• 公開（公告）號: CN104111331A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發明（設計）人: 文朝慧;王軍平;周小平;李儒;趙政
• 申請（專利權）人: 甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

1.一種應用于檢測菊科植物病毒病的抗體芯片，其特征在于，包括有基膜和在基膜上分別點制的危害菊科植物的7種病毒的特異性捕獲抗體，所述的7種病毒的捕獲抗體：抗-菜豆黃花葉病毒、抗-南芥菜花葉病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黃瓜花葉病毒、抗-煙草脆裂病毒、抗-煙草環斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上還封裝有3個陽性質控點P，點制為堿性磷酸酶標記的IgG和封裝有3個陰性質控點N，點制為pH9.2-9.8的碳酸鹽緩沖液。

2.如權利要求1所述的應用于檢測菊科植物病毒病的抗體芯片的制備方法，其特征在于步驟為：

(1)抗體稀釋：以捕獲抗體稀釋緩沖液稀釋7種多克隆捕獲抗體，稀釋后的捕獲抗體濃度為抗體原液的1/18-1/3倍，即BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV用于點樣的抗體濃度依次為抗體原液的1:17、1:14、1:17、1:14、1:15、1:3和1:15倍，同時芯片上加1:10稀釋的堿性磷酸酶標記驢抗山羊IgG原液作為芯片的陽性質控點，芯片點樣液作為陰性質控點；點樣緩沖液為：碳酸鈉Na₂CO₃1.59g，碳酸氫鈉NaHCO₃2.93g，疊氮化鈉NaN₃0.2g，雙蒸水ddH₂O?1000mL，pH?9.6；

(2)點樣：將硝酸纖維素膜片印跡后，去離子水浸泡20min，37℃恒溫箱中干燥20min。按芯片點陣，每種多克隆捕獲抗體重復點制2個點；分別針對7種病毒的捕獲抗體：抗-菜豆黃花葉病毒、抗-南芥菜花葉病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黃瓜花葉病毒、抗-煙草脆裂病毒、抗-煙草環斑病毒、抗-番茄斑萎病毒依次點在編號1-7的位置；在P和N的位置分別點陽性質控、陰性質控；

(3)將上述試劑按陣列排布點樣于基膜表面，每點0.3uL，點間距0.2cm。點樣完畢后，將抗體芯片置于濕盒中，濕度為45％，37℃固定30min；

(4)封閉：將固定好的抗體芯片用1％無蛋白封閉液37℃于濕盒中封閉1h，除去封閉液后，2-8℃保存，即為抗體芯片成品。

3.一種應用于檢測菊科植物病毒病的抗體芯片試劑盒，其特征在于，包括有抗體芯片；7種病毒相對應的堿性磷酸酶標記的檢測抗體：抗-菜豆黃花葉病毒、抗-南芥菜花葉病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黃瓜花葉病毒、抗-煙草脆裂病毒、抗-煙草環斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；菊科植物病毒的陽性對照物，包括有菜豆黃花葉病毒的陽性對照物、南芥菜花葉病毒的陽性對照物、菜豆萎蔫病毒的陽性對照物、黃瓜花葉病毒的陽性對照物、煙草脆裂病毒的陽性對照物、煙草環斑病毒的陽性對照物、番茄斑萎病毒的陽性對照物；堿性磷酸酶；檢測抗體稀釋緩沖液；洗滌緩沖液PBST；堿性磷酸酶顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍。

4.一種應用于檢測菊科植物病毒病的抗體芯片試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟為：

(1)將檢測樣品與抗體芯片4℃隔夜孵育；所述的抗體芯片為權利要求1；

(2)洗滌后再加入相應的植物病毒檢測抗體雜交孵育，繼續反應4h；

(3)洗滌后加入顯色工作液顯色；

所述的菊科植物病毒捕獲抗體分別為菜豆黃花葉病毒Bean?yellow?mosaic?virus，BYMV、南芥菜花葉病毒Arabis?mosaic?virus，ArMV、菜豆萎蔫病毒Broad?bean?wilt?virus，BBWV、黃瓜花葉病毒Cucumber?mosaic?virus，CMV、煙草脆裂病毒Tobacco?rattle?virus，TRV、煙草環斑病毒Tobacco?ringspot?virus，TRSV和番茄斑萎病毒Tomato?spotted?wilt?virus，TSWV捕獲抗體中的至少一種；

以IgG作為質控對照。