[發(fā)明專利]一種建立和培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410382321.2
• 申請(qǐng)日: 2014-08-06
• 公開（公告）號(hào): CN104140951A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王朔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市科暉瑞生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/074
• 分類號(hào): C12N5/074;C12N5/071;C12N5/10
• 代理公司: 深圳冠華專利事務(wù)所(普通合伙) 44267
• 代理人: 諸蘭芬

1.一種建立和培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.制備人成纖維樣細(xì)胞飼養(yǎng)層：取人成纖維樣細(xì)胞，接種至培養(yǎng)皿上用10毫克/毫升絲裂霉素C提前處理3個(gè)小時(shí)，去除絲裂霉素C；

b.培養(yǎng)：重編程體細(xì)胞，生成人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植于步驟a中制備的飼養(yǎng)層中培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立和培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟a中人成纖維樣細(xì)胞采用如下方法生成：

a1：使用人包皮成纖維細(xì)胞重編程得到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞5.9細(xì)胞系；

a2：在基質(zhì)膠上維持培養(yǎng)5.9細(xì)胞系7天；

a3：使用1毫克/毫升分散酶于37℃環(huán)境下消化5-7分鐘后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液為1，培養(yǎng)液每天更換；

a4：當(dāng)培養(yǎng)于基質(zhì)膠中的5.9細(xì)胞系達(dá)到80％滿時(shí)，去除1培養(yǎng)基后用1×PBS清洗兩次，然后直接添加人成纖維樣細(xì)胞培養(yǎng)基使5.9細(xì)胞系開始定向分化，前四天每天更換培養(yǎng)基，之后每2天更換一次；

a5：誘導(dǎo)6～12天后將長滿的細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化，并以1×10⁶個(gè)/孔的濃度把細(xì)胞接種在基質(zhì)膠預(yù)處理的6孔板上；當(dāng)細(xì)胞再次長滿時(shí)，將細(xì)胞消化并以2×10⁵個(gè)/孔的濃度接種到0.1％明膠預(yù)處理的6孔板中；

a6：在明膠處理過的的平板上培養(yǎng)3-5天后細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，即為人成纖維細(xì)胞樣。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立和培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法,其特征在于,所述步驟b具體包括如下步驟：

b1:取1×10⁴人包皮成纖維細(xì)胞，采用桿狀病毒介導(dǎo)的鋅指核酸酶在第一天和第八天兩次轉(zhuǎn)染，將ZFN基因和OSKM基因同時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，使得OSKM基因特異性地整合到人包皮成纖維細(xì)胞的AAVS1位點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)液為FibroGRO^TM-LS完全培養(yǎng)基；

b2：使用200微克/毫升G418藥篩10天后，將存活的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到人成纖維樣細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)形成細(xì)胞群落，得到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種建立和培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟b1中，表達(dá)ZFN基因和OKSM基因的桿狀病毒每個(gè)細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)為100。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種建立和培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于，所使用的5.9細(xì)胞為60次連續(xù)傳代的細(xì)胞。