[發明專利]一種T5核酸外切酶在大腸桿菌中的制備方法

在審

• 申請號: 201410382116.6
• 申請日: 2014-08-05
• 公開（公告）號: CN104152426A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 孫啟明;徐衛國;張亞;陳遠
• 申請（專利權）人: 孫啟明
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種T5核酸外切酶在大腸桿菌中的制備方法，其特征在于所述的T5外切酶的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。

2.如權利要求1所述的一種T5核酸外切酶在大腸桿菌中的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：通過載體構建將密碼子優化的T5核酸外切酶基因克隆到pGEX載體中，在低溫條件下通過與GST融合表達，來提高蛋白表達量和可溶性；所述T5核酸外切酶基因序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示；T5核酸外切酶與GST在宿主菌中融合表達，融合表達蛋白為GST-T5?Exonuclease；所述融合表達蛋白含有GST標簽，用GST柱子純化融合蛋白。

3.根據權利要求2所述的一種T5核酸外切酶在大腸桿菌中的制備方法，其特征在于所述載體構建步驟具體為如下步驟：

引物設計如下：

所用正向引物為：

5’CATGGGATCCGACGACGACGACAAGATGAGCAAATCGTGGGGGAAATTCAT-3’；下劃線部分為BamH?I的酶切位點；

所用反向引物為：

5’-CATGCTCGAGTCACTGTTCTGCAATTTCGA-3’；下劃線部分為Xho?I的酶切位點；

在正向引物中有一個BamH?I的酶切位點以及編碼腸激酶識別位點DDDDK的序列，反向引物中有一個Xho?I的酶切位點；以合成T5核酸外切酶基因為模板，用PCR的方法擴增T5核酸外切酶編碼序列，PCR反應的條件為：94℃熱變性一分鐘，55℃退火一分鐘，72℃延伸90秒，共進行25個循環；pGEX和純化的PCR產物采用BamH?I和Xho?I進行雙酶切，然后將PCR酶切片段回收插入pGEX的多克隆位點；pGEX是一個在N端融合GST-tag的原核表達載體；對重組表達載體pGEX-T5核酸外切酶進行DNA測序；分析其閱讀框和編碼序列的正確性。

4.根據權利要求2所述的一種T5核酸外切酶在大腸桿菌中的制備方法，其特征在于所述融合表達步驟具體為如下步驟：

將T5核酸外切酶融合蛋白表達載體pGEX-T5核酸外切酶轉入表達宿主菌E.coli?BL21(DE3)，挑取單克隆接種至新鮮的含50mg/l的氨芐青霉素的LB液體培養基；待細菌長至OD600為0.6左右，加入終濃度為0.4mM的IPTG誘導T5核酸外切酶的表達；16℃誘導12個小時后收集菌體。

5.根據權利要求2所述的一種T5核酸外切酶在大腸桿菌中的制備方法，其特征在于所述純化融合蛋白步驟具體為如下步驟：

收集一升發酵液的細胞，并用40ml冰浴的buffer?A重懸，所述buffer?A的構成為20mMTris-HCl，50mM?NaCl，0.5％?Triton-X100，10％甘油，超聲裂解細胞，離心取上清，上清通過buffer?A預平衡的GST親和柱，上樣完畢用buffer?A充分洗滌至基線，而后用buffer?B洗脫目的蛋白，所述buffer?B的構成為50mM?Tris-HCl，20mM?Reduced?Glutathione，10％甘油；

將結合了GST-T5核酸外切酶透析后用EK酶切，按照EK(mg)∶目標蛋白(mg)＝1∶10000的比例將EK加入融合蛋白溶液中開始酶切反應，酶切條件為4℃，16小時，酶切溶液通過GST親和柱收集流出液，流出液進一步經強陰離子交換吸附層析Q-Sepharose純化。