[發(fā)明專利]斜帶石斑魚ctrp9基因、編碼蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410380895.6
• 申請日: 2014-08-05
• 公開（公告）號: CN104152461A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李文笙;楊國坤;秦超彬
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C07K14/575;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;A23K1/165;A23K1/18;C12R1/84
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種斜帶石斑魚ctrp9基因、編碼蛋白及其應(yīng)用，所述應(yīng)用為在制備促生長劑或飼料添加劑中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

脂肪作為動物貯存能量的組織，在調(diào)節(jié)和控制機體的代謝中起著重要的作用，它能分泌多種具有生物活性的細胞因子。在哺乳類動物中脂聯(lián)素（Adiponectin）是一種由脂肪細胞分泌的細胞因子蛋白，主要參與調(diào)節(jié)葡萄糖水平和脂肪的降解，其次還包括抗炎、抗動脈粥樣硬化、促血管形成因子和抗血管形成因子的特性。ctrp9是與adiponectin同源性最近的CTRP家族的成員，由四個區(qū)域，第一個區(qū)域為信號肽；第二個區(qū)域為可變區(qū)；第三個區(qū)域為膠原蛋白的相似區(qū)；最后一個區(qū)域為球狀區(qū)，也為功能區(qū)。最近研究表明，ctrp9與adiponectin有相同的功能，參與調(diào)節(jié)葡萄糖水平和脂肪的降解，還有參與攝食、抗炎作用、免疫反應(yīng)的功能，并且有實驗證明CTRP9可能通過與AdipoR1結(jié)合，增加AMPK/Akt/eNOS磷酸化，增加血管活性。?

石斑魚屬鮨科(Serranidae)，石斑魚屬(Epinephelus)，為暖水性的大中型海產(chǎn)魚類。石斑魚營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細嫩潔白，類似雞肉，素有“海雞肉”之稱。石斑魚又是一種低脂肪、高蛋白的上等食用魚，被港澳地區(qū)推為我國四大名魚之一，是高檔筵席必備之佳肴。目前石斑魚的飼料還是以動植物蛋白作為主要添加劑，然而動植物蛋白成本較高，如果能夠提高石斑魚對糖脂的利用，對生產(chǎn)成本會有很大的降低，但目前在石斑魚人工養(yǎng)殖中還沒有一種能有效促進糖脂利用的餌料添加劑。?

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種斜帶石斑魚ctrp9基因，其核苷酸序列如SEQ?IDNO：1所示。?

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有斜帶石斑魚gctrp9基因的表達載體；?

本發(fā)明的另一目的在于提供上述載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株；

本發(fā)明的另一目的在于提供了利用上述酵母重組酵母菌株得到重組斜帶石斑魚gCTRP9的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因在制備魚苗苗種促生長劑或添加劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明克隆了斜帶石斑魚的ctrp9基因，并得到了3’UTR和部分5’UTR?？寺〉姆椒ㄊ浅Ｒ?guī)的基因克隆方法，利用同源物種的基因比對設(shè)計簡并引物，經(jīng)過PCR后得到中間片段，然后根據(jù)中間片段的序列分別設(shè)計兩個5’RACE的下游引物和兩個3’RACE的上游引物，在利用通用引物AAP和AUAP進行5’和3’嵌套PCR得到了ctrp9的ORF、5’UTR和3’UTR。最后設(shè)計克隆ORF的引物，PCR后把得到目的基因連接到PCR2.1載體為PCR2.1-ctrp9。?

本發(fā)明構(gòu)建了含有斜帶石斑魚gCTRP9的畢赤酵母表達載體。這個載體的構(gòu)建方法是按常規(guī)方法，利用自己所構(gòu)建的載體PCR2.1-?ctrp9為模板，通過PCR方法合成帶有酶切接頭的斜帶石斑魚gctrp9基因，經(jīng)酶切和分離純化后，接入到已有的載體pPICZaA的相應(yīng)酶切位點（即EcoRI-HF和NotI）之間，即構(gòu)建成所需的含有斜帶石斑魚gctrp9基因的表達載體pPICZaA-?gctrp9。?

本發(fā)明還用上述含有斜帶石斑魚gctrp9基因的相應(yīng)表達載體構(gòu)建了能高效表達斜帶石斑魚gctrp9基因的酵母重組株。?

本發(fā)明的上述能表達斜帶石斑魚gCTRP9酵母重組菌株優(yōu)先由含有斜帶石斑魚gctrp9基因的表達載體pPICZaA-?gctrp9轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33而得到的菌株，命名為pPICZaA-?gctrp9-?X33。?

本發(fā)明還提供了利用上述畢赤酵母重組株生產(chǎn)斜帶石斑魚gCTRP9的方法。先將菌種接種在含有BMGY的液體培養(yǎng)基中，28℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)18-24小時，然后離心收集菌體并重懸菌體于BMMY液體培養(yǎng)基中，并加入吐溫-80，使其終濃度為0.4%，28℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，18-24小時后向培養(yǎng)液中加入甲醇，使終濃度為0.5%，然后28℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，18-24小時后收集上清，經(jīng)分離純化得到重組斜帶石斑魚gCTRP9產(chǎn)品?