[發明專利]一株抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請號: 201410377894.6
• 申請日: 2014-08-04
• 公開（公告）號: CN104130980A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 匡華;孔娜;胥傳來;徐麗廣;馬偉;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C12P21/08;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一株雜交瘤細胞株及其產生抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體的應用，屬于食品安全免疫檢測技術領域。

背景技術

甲羥孕酮（Medroxyprogesterone，MP）屬于孕激素，作用與天然黃體酮類似，是人工合成的黃體酮衍生物，因此又稱為安宮黃體酮。醫學方面，主要是用于痛經、功能性閉經、習慣性流產等，大劑量可以用作長效的避孕針。畜牧養殖方面，主要用來促進動物生長，但是長期大量使用會對動物體造成危害。目前，很多國家都規定飼養動物禁止使用激素，我國也出臺相應的政策禁止激素類的使用。現有的檢測MP方法包括高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用（LC-MS）、氣質聯用（GC-MS）等。盡管這些方法靈敏度高，但是繁瑣的前處理步驟，檢測的高費用，都無法滿足現場大批量快速檢測的需求。相比較，酶聯免疫分析技術（ELISA）提供了一種檢測MP快速、靈敏、簡便的方法。在目前MP免疫檢測方法中，關鍵是單克隆抗體對MP的高特異性和高靈敏度，以致于難以得到準確客觀的結果。

發明內容

本發明的目的是提供一株抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株，該細胞株制備的單克隆抗體對MP具有較好的特異性和較高的檢測靈敏度，為建立MP的免疫學檢測方法奠定基礎。

本發明的技術方案，一株抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為單克隆細胞株E號，又稱雜交瘤細胞株4F9，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.9305，保藏日期為2014年5月28日。

所述抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株的應用，免疫得到的抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體，甲羥孕酮的50%?抑制濃度IC₅₀為0.067ng/mL，與其他類似物交叉反應率均小于0.1%。

本發明提供4F9細胞株的基本制備過程：

（1）甲羥孕酮免疫原的制備與鑒定：甲羥孕酮為原料，通過氫氧化鉀和二溴乙酸進行取代，得到甲羥孕酮半抗原（MP-2CME），LC-MS鑒定結果。利用混合酸酐法將其與載體蛋白牛血清白蛋白（BSA）或者雞血清白蛋白（OVA）偶聯，用紫外鑒定結果；

（2）小鼠的免疫過程：將抗原與福氏完全佐劑同比例混合，完全乳化后，通過背部皮下多點注射免疫8-10周BALB/c小鼠，每只劑量100μL。免疫過程共五次：第一次用福氏完全佐劑免疫，加強免疫用福氏不完全佐劑，最后一次用生理鹽水稀釋免疫原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；

（3）細胞融合與細胞株建立：沖擊免疫后第三天，通過聚乙二醇（PEG4000）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養基培養，利用間接ELISA法檢測分泌MP的細胞株，利用間接競爭ELISA法測定該細胞株的抑制效果，篩選最好抑制的陽性細胞株進行三次亞克隆，最終獲得雜交瘤細胞株4F9；

（4）雜交瘤細胞株的應用：將所得到的單克隆抗體配置在檢測MP的免疫試劑盒中，也將該抗體制成用于檢測MP的膠體金免疫試紙條。

免疫得到的抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體，免疫所用之甲羥孕酮半抗原（MP-2CME）的制備步驟如下：甲羥孕酮0.1mmol溶解于3mL無水二甲亞砜為A液，二溴乙酸0.2mmol溶解于1.4mL無水二甲亞砜為B液，A液中加入氫氧化鉀粉末1.5mmol，室溫條件下攪拌至溶液顏色變為微黃色，將B液逐滴加入到A液中，黃色逐漸加深，室溫反應4h，用50mL冰水終止反應，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，將水相用2mol/L鹽酸酸化得黃色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黃色甲羥孕酮半抗原MP-2CME粉末。

免疫所用之甲羥孕酮完全抗原的制備步驟如下：稱取甲羥孕酮半抗原0.01mmol溶解于600μL無水N,N-二甲基甲酰胺DMF，置于4℃冰浴中攪拌，溶液預冷后加入0.025mmol三正丁胺，冰浴條件攪拌30min，加入0.025mmol氯甲酸異丁酯，繼續冰浴攪拌1h，得活化后小分子溶液C液；稱取載體蛋白BSA?0.00016mmol溶解于pH?9.6的碳酸鹽緩沖液CBS中，得蛋白溶液；在冰浴條件下，將C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反應8h；反應結束后，將溶液離心，取上清，得到甲羥孕酮完全抗原混合液。

將免疫得到的抗甲羥孕酮特異性單克隆抗體應用于制備甲羥孕酮的免疫檢測試劑盒。

所述試劑盒包括膠體金免疫試紙條和試劑；

膠體金免疫試紙條：襯板1、樣品墊2、結合墊3、吸水墊4和包被膜5；在襯板1上依次銜接黏附樣品墊2、結合墊3、包被膜5和吸水墊4；