[發明專利]葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法

有效

• 申請號: 201410376892.5
• 申請日: 2014-07-30
• 公開（公告）號: CN104090062A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 李大婧;肖亞冬;張鐘元;劉春泉
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明涉及葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法，屬于分析技術領域。

二、背景技術

葉黃素又名“植物黃體素”，是一種無V_A活性的含氧類胡蘿卜素，廣泛存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中。十幾年的科學研究表明葉黃素是構成人眼視網膜黃斑色素的主要組成部分。葉黃素不僅可以過濾對黃斑損傷作用最強的藍光，而且能夠淬滅和捕獲高能量藍光誘導產生的活性氧自由基，從而起到保護視力和抗氧化的作用。因此，經常補充葉黃素可以降低老年性黃斑退化病(Age-related?Macular?Degeneration，簡稱AMD)的患病風險。另外，葉黃素還具有預防白內障和人體衰老、抗癌、抗誘變、延緩早期動脈硬化等生理功能，是一種營養健康的功能性天然色素。

自然界中葉黃素以全反式構象為主，富含或強化葉黃素制品在加工貯藏過程中，全反式葉黃素會受到光、氧和熱等外界條件的影響產生很多順式異構體，順式結構在物化性質和生理功能上與全反式差別較大。因此，建立一種準確快速的葉黃素順反異構體的定性、定量分析方法對葉黃素在食品工業中的生產和應用具有重要意義。

由于靈敏、準確、快速等優點，高效液相色譜和質譜聯用技術已成為葉黃素定性定量分析的主要方法。C₃₀柱是繼C₁₈柱之后又一廣泛應用的反相吸附色譜固定相，在分離類胡蘿卜素幾何異構體方面顯示出獨特的優勢，又稱類胡蘿卜素柱。張艷等報道了一種YMC-C₃₀色譜柱分離葉黃素及其異構體的方法，使用的流動相為甲基叔丁基醚、甲醇和乙腈，葉黃素異構體分離效果不是很好，并且甲基叔丁基醚價格較貴；李秀霞等報道了用YMC-C₃₀色譜柱分離鑒定玉米蛋白粉中的全反式葉黃素及其順式異構體，使用的流動相為甲醇和丙酮，但洗脫時間較長。國外有報道使用水-甲醇、水-乙腈為流動相對葉黃素順、反異構體進行分離，但這兩種方法所用時間都較長，分別為70min和45min，效率較低。尚未見葉黃素雙順式異構體檢測方面的報道。因此，建立一種快速經濟有效的葉黃素單順式、雙順式異構體的定性定量分析方法顯得十分必要。

三、發明內容

技術問題

本發明的目的在于提供一種快速、準確的葉黃素單順式、雙順式異構體的檢測方法，可以對葉黃素單順式、雙順式異構體進行準確的定性和定量分析。

技術方案

本發明包括以下步驟：

1.葉黃素單順式、雙順式異構體樣品的制備

吸取大豆油4.6mL于具塞刻度試管中，分別在130～190℃下于恒溫油浴鍋中避光加熱。稱取10mg反式葉黃素于試管中并加入400μL正己烷，超聲溶解30s，頻率為40kHz。將正己烷-葉黃素溶液注入油脂中，制成工作溶液，這一過程須在1min內完成。定時移取200μL樣品于小試管中，與2mL丙酮混合均勻后，迅速置于-20℃冰箱保存24h，使油脂中的三酰甘油酯結晶。通過0.45μm膜過濾于樣品瓶中待用。整個實驗過程中，試管敞口不密封，所有操作均在避光下完成。

2.葉黃素單順式、雙順式異構體的HPLC檢測

取20μL制備的葉黃素單順式、雙順式異構體樣品進行檢測，二極管陣列檢測器，YMC?Carotenoid?C₃₀色譜柱，以甲醇∶乙腈∶二氯甲烷＝50∶30∶20為流動相，時間13min，流速1.0mL/min，柱溫25℃，進樣量20μL，掃描波長300～500nm，檢測波長450nm。

3.葉黃素單順式、雙順式異構體的質譜檢測

采用大氣壓化學電離源，正離子質譜(APCI⁺/MS)掃描模式，色譜柱流出組分進入質譜儀的流速為10μL/min，掃描范圍m/z＝80～900，氣化溫度350℃，干燥氣體流速5L/min，電暈電流4μA，破碎電壓150v，毛細管電壓2500V。

4.建立全反式葉黃素標準曲線

準確稱取1mg全反式葉黃素標準品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混勻，制成濃度為40μg/mL的標準液。再分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL標準液置于10mL容量瓶中，混勻，制成2、4、6、8、10μg/mL的全反式葉黃素系列標準液。按照上述的色譜條件測定，以進樣量為橫坐標，相應的吸收峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。

有益效果