[發明專利]H7N9亞型禽流感病毒診斷環介導等溫擴增試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 201410375338.5
• 申請日: 2014-08-01
• 公開（公告）號: CN104099430A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 鄒明強;薛強;殷宏
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一套用于病毒快速診斷的引物組、試劑盒及使用方法，尤其涉及一套用于診斷H7N9亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增引物組、試劑盒及其使用方法，屬于禽流感病毒檢測領域。

背景技術

禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類的急性高度致死性傳染病。1878年發生在意大利，隨后，在其它歐洲國家、南美、東南亞、美國和前蘇聯也時有發生。由于禽流感的變異太多，不宜有效檢測控制，其疫情傳播的風險性引起了國際社會的高度關注。2005年9月29日，被聯合國秘書長安南任命為聯合國禽流感事務協調員的世界衛生組織(WHO)專家大衛納巴羅(David?Nabarro)博士說：“下一場流感爆發隨時可能到來，而根源可能正是目前肆虐于亞洲地區的禽流感病毒的某種變體。如果出現一場流感大爆發，500萬到1.5億人將會喪生”。據亞洲開發銀行初步估計，如果爆發一場嚴重的禽流感疫情，亞太地區在短期內就將蒙受2500億至2900億美元(約4235億至4912億新元)的經濟損失。

H7N9亞型禽流感病毒是于2013年3月底全球首次發現的新亞型流感病毒，臨床癥狀表現主要為：高燒，咳嗽，氣促，呼吸困難，缺氧，胸片顯示下呼吸道渾濁，浸潤，片狀陰影。感染并發癥包括膿毒性休克，呼吸衰竭，急性呼吸窘迫綜合癥，難治性低氧血癥，急性腎功能障礙，多器官功能障礙，橫紋肌溶解癥，肝性腦病，細菌和真菌感染等。2013年4月經調查，H7N9亞型禽流感病毒基因來自于東亞地區野鳥和中國上海、浙江、江蘇雞群的基因重配。截止至2013年8月，實驗室確診H7N9型感染病例共計132人，其中43例死亡，病例分布于北京、上海、江蘇、浙江、安徽、山東、河南、臺灣、福建等地。新型H7N9亞型禽流感的出現，給全社會帶來了恐慌，因此研究開發一種行之有效的H7N9亞型禽流感病毒快速診斷試劑盒，具有極其重要的意義。

目前，禽流感病毒的臨床診斷方法主要包括病毒分離方法、血清學檢測方法和分子生物學方法三大類。其中，臨床應用的分子生物學方法主要指實時熒光定量PCR核酸分子診斷方法，也是診斷H7N9亞型禽流感病毒最常用的方法。然而，傳統的PCR反應對溫度具有一定的依賴性，要求精密控溫系統，檢測時間長，實驗成本高。環介導等溫擴增(LAMP)法是2000年由日本Notomi博士發明的一種新的核酸擴增技術，更具有簡便、快速、敏感性高和特異性強等優點。經過十幾年的發展，該方法得到不斷完善，尤其在結果判定方面，已有多種肉眼可視的方法及實時熒光檢測法得到廣泛應用，可從源頭上控制住由電泳開蓋造成的氣溶膠污染，尤其適合于現場快速檢測以及床旁檢測。

發明內容

本發明的主要目的是提供一套用于H7N9亞型禽流感病毒快速診斷的環介導等溫擴增引物組，由HA基因環介導等溫擴增引物組、NA基因環介導等溫擴增引物組構成，可用于H7N9亞型禽流感病毒環介導等溫擴增反應。

所述H7N9亞型禽流感病毒環介導等溫擴增引物組是通過大量比對Genbank中下載的不同亞型H7N9甲型禽流感病毒HA及NA的核酸序列，針對特異性差異較大的片段所設計。其中，HA基因引物組包括一對外引物、一對內引物和一對環引物，NA基因引物組包括一對外引物和一對內引物。HA基因引物組的內引物與外引物按6∶1-12∶1的比例配制成，優選比例為8∶1，環引物與內引物的比例為1∶2；NA基因引物組的內引物與外引物按6∶1-12∶1的比例配制成，優選比例為8∶1。

所述的環介導等溫擴增反應預混液，可以是使擴增產物發出熒光信號的一種商品化試劑盒Isothermal?Master?Mix或者等效的其他試劑盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜堿、MgSO₄和緩沖溶液組成，及逆轉錄酶如AMV?reverse?transcriptase或者等效的其他逆轉錄酶構成。試劑盒中還同時引入一組陽性質控品和陰性質控品，其中HA基因及NA基因陽性質控品，為經體外轉錄純化得到的RNA片段，其濃度均為2x10¹⁰copies/μL，陰性質控品是不含各引物組的介質溶液。

所述H7N9亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增反應體系的總體積為25μL，其中包括HA/NA基因環介導等溫擴增引物組溶液6μL/4μL，環介導等溫擴增反應預混液14μL/16μL，待測試樣或者陽性質控品或者陰性質控品各5μL；環介導等溫擴增熒光檢測系統的擴增程序為：①63℃，60min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min。