[發(fā)明專利]一種土壤或沉積物樣品的微生物采集方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410374991.X
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104232738A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張勇;鄧詩財;郝純;梅海
• 申請（專利權(quán)）人: 盎億泰地質(zhì)微生物技術(shù)（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/24
• 分類號: C12Q1/24
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種低微生物量的土壤或沉積物樣品的微生物采集方法。

背景技術(shù)

目前用于分子生物學(xué)分析的微生物樣品采集和保存方法主要是現(xiàn)場采集后迅速低溫冷凍，即在野外現(xiàn)場取一定量土壤或沉積物樣品密封后，使用冰箱、液氮或干冰等方法冷凍保存，運輸過程全程需保持低溫冷凍狀態(tài)。該方法存在以下問題：

1)對溫度要求嚴(yán)格。低溫冷凍保存必須保證樣品從采集到運輸過程，均需要嚴(yán)格保證低溫過程，而在野外施工時常常難以保證低溫。

2)運輸困難。使用冰箱、干冰或液氮保存的冷凍樣品，從野外運到實驗室的過程，實現(xiàn)起來比較困難。

3)低生物量樣品難以操作。在沙漠、戈壁灘、凍土區(qū)、海洋等微生物含量比較低的極端環(huán)境使用時，需要采集大量樣品進行冷凍保存，才能保證微生物量能滿足后續(xù)實驗要求，這對樣品的采集和保存運輸均提出了較高的要求。

鑒于低溫冷凍方法存在的弊端，開發(fā)一種簡潔有效的樣品采集與保存方法對于低微生物量的土壤或沉積物樣品的后續(xù)分子生物學(xué)分析尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有冷凍保存的弊端，為低微生物量的野外現(xiàn)場土壤或沉積物樣品提供一種新的微生物采集方法。

本發(fā)明提供的土壤或沉積物樣品的微生物采集方法，包含以下步驟：

1)在除菌處理過的堿性高滲透壓緩沖液中加入土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體；

2)在上層液體中加入同樣的土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體；

3)重復(fù)步驟2；

4)將所得上層液體密封后常溫保存。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中堿性高滲透壓緩沖液為pH為8.0-10.0的高滲緩沖液。

更優(yōu)選地，所述高滲緩沖液為蔗糖緩沖液。

作為優(yōu)選，所述除菌處理為用孔徑為0.2um的水系微孔濾膜處理。

作為優(yōu)選，所述蔗糖緩沖液成分為：10-50mmol/L?EDTA,100-500m?mol/L?NaCl，0.5-2M蔗糖，20-100m?mol/L?Tris-HCl。

作為優(yōu)選，步驟3)所述重復(fù)為至少重復(fù)3次。

作為優(yōu)選，步驟1)與步驟2)液體體積與樣品重量以ml/g計為(20-50):1。

作為優(yōu)選，所述步驟4)重復(fù)至少3次。

試驗結(jié)果顯示，使用本發(fā)明所述方法采集樣品提取的DNA濃度比常規(guī)冷凍方法提取的DNA濃度高；通過PCR擴增進一步確認(rèn)本發(fā)明所用方法保存的DNA的有效性，擴增產(chǎn)物使用濃度為1.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效率，結(jié)果顯示，使用本發(fā)明所述方法采集保存的DNA，用于PCR擴增時，可獲得更為高效的擴增結(jié)果。以上結(jié)果說明，本發(fā)明所述方法作為常規(guī)冷凍保存方法的替代方法，適用于沙漠、戈壁、凍土區(qū)、海洋等微生物量低的環(huán)境中土壤或沉積物分子生物學(xué)樣品的采集與保存。

附圖說明

圖1為低微生物量的樣品細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。M為分子量Marker，泳道1-6為本發(fā)明所述保存方法提取的DNA，泳道7-12為常規(guī)冷凍保存方法提取的DNA。

圖2為低微生物量的樣品細(xì)胞DNA使用16S?rDNA引物349F和806R進行PCR擴增之后的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為分子量Marker，泳道1-10為常規(guī)冷凍樣品PCR擴增產(chǎn)物，泳道11-20為本發(fā)明所述方法保存樣品PCR擴增產(chǎn)物。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種低微生物量的分子生物學(xué)樣品采集與保存方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。

實施例1：

所涉及區(qū)域是青藏高原一塊高海拔草甸區(qū)，該地區(qū)屬于永久凍土帶，地表有少量植被，微生物量低，土壤樣品中含有大量石塊。要在該地區(qū)開展天然氣水合物等勘探，研究微生物多樣性，需要布設(shè)大規(guī)模測線或測網(wǎng)，需要采集大量地表土壤樣品。使用常規(guī)方法采樣，因微生物量低，每個站點需采集大量樣品，既耗時又難以運輸，且高海拔野外地區(qū)難以實現(xiàn)樣品快速冷凍。