[發明專利]流產嗜性衣原體巨噬細胞感染增強因子的單克隆抗體及其雜交瘤細胞

在審

• 申請號: 201410374977.X
• 申請日: 2014-08-01
• 公開（公告）號: CN104130326A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 周繼章;李兆才;曹小安
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及一種流產嗜性衣原體MIP蛋白的單克隆抗體和能分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞，屬于生物檢測領域。

背景技術

流產嗜性衣原體(Chlamydophila?abortus)是革蘭氏陰性專性細胞內寄生性原核生物，屬于衣原體科(Chlamydiaceae)嗜性衣原體屬(Chlamydophila)成員，具有廣泛的宿主嗜性，主要寄生于動物的生殖道黏膜上皮細胞，能感染牛、綿羊、山羊和豬等多種動物，可引起懷孕母畜流產、早產、死胎、木乃伊胎或弱胎，公畜生殖系統炎癥等多種慢性接觸性傳染病；并且流產嗜性衣原體也能夠感染人類，導致孕婦流產，是一種重要的人畜共患病病原。

近年來，流產嗜性衣原體在我國各省區的豬群、牛群和羊群中普遍感染，由此導致的流產率最高達50％以上，成為目前畜牧業最嚴重的疾病病原之一，造成了巨大的經濟損失。

為了有效防治流產嗜性衣原體，及時、準確、盡早的發現衣原體并進行有效的診斷是確定動物患衣原體的基礎。目前針對流產嗜性衣原體，主要的檢測方法是采用主要外膜蛋白(MOMP)、多型外膜蛋白(POMP)和脂多糖(LPS)等作為目的抗原，采用特異性檢測LPS的直接免疫熒光檢測技術，以MOMP，POMP為包被抗原的酶聯免疫吸附試劑盒以及根據其編碼基因ompA建立的PCR和real-time?PCR技術等，具體表現成型的產品為衣原體間接血凝試驗(IHA)試劑盒。

上述方法中，采用PCR技術診斷周期長、適用范圍窄，不利于臨床推廣，無法用于大規模養殖的牛、綿羊、山羊和豬等多種動物的衣原體檢測診斷。

IHA試劑盒雖然實現了規模生產和普及應用，但是存在靈敏度低，特異性較差的缺點，該類試劑盒的部分改進產品雖然靈敏度有所提高，但是生產成本過高，無法普及應用。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明公開了流產嗜性衣原體巨噬細胞感染增強因子(Macrophage?Infectivity?Potentiator，MIP)的單克隆抗體以及能夠用于分泌生產該單克隆抗體的雜交瘤細胞，本發明的流產嗜性衣原體MIP蛋白單克隆抗體能針對流產嗜性衣原體MIP蛋白進行有效檢測，具有很強的特異性，用于檢測流產嗜性衣原體能提供高效及時、準確的防治信息。

為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的：

流產嗜性衣原體巨噬細胞感染增強因子(即MIP蛋白，以下均采用該縮寫)的單克隆抗體，由流產嗜性衣原體MIP蛋白作為抗原免疫小鼠分泌獲得，所述流產嗜性衣原體MIP蛋白具有序列表1所示氨基酸序列。

上述的流產嗜性衣原體MIP蛋白既可以通過人工合成，也可以通過大腸桿菌等原核生物對流產嗜性衣原體MIP蛋白的編碼基因進行表達獲得。

優選的，為了便于流產嗜性衣原體MIP蛋白質的純化，在流產嗜性衣原體MIP蛋白的氨基末端或羧基末端連接有6×His標簽。

為了大量富集和生產上述流產嗜性衣原體MIP蛋白的單克隆抗體，本發明還公開了一種雜交瘤細胞，用于分泌流產嗜性衣原體MIP蛋白的單克隆抗體，該雜交瘤細胞采用下述方法制備：

1)通過人工合成或者原核表達獲得流產嗜性衣原體MIP蛋白，其具有序列表1所示的氨基酸序列；

2)注射流產嗜性衣原體MIP蛋白免疫小鼠，免疫完成后從小鼠采集血樣檢測抗體效價，選擇效價數量級不低于10⁷的小鼠注射加強免疫；

3)在無菌條件下取上述免疫后的小鼠脾臟，制備脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的懸液，在融合劑作用下進行融合；

4)將融合細胞用HAT選擇性培養基懸浮均勻并加入到鋪有飼養細胞的細胞板中，在5％CO₂培養箱內培養；

5)融合細胞克隆生長完成后，對所有有克隆生長的培養上清進行檢測，多次篩選和克隆化培養后得到分泌流產嗜性衣原體MIP蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。

優選的，所述MIP蛋白的氨基末端或梭基末端連接有6×His標簽。

在上述中，所用小鼠為BALB/c小鼠。

在上述中，飼養細胞是小鼠原代腹腔巨噬細胞。

在上述中，步驟2)免疫注射方式為腹部多點皮下注射或抗原液腹腔注射。