[發明專利]基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實現方法

在審

• 申請號: 201410374683.7
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104140945A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;孫玉靜;毛亮;支月娥;唐冬;衛星;羅艷青
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/14;C12R1/19;C12R1/465
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種生物基因工程技術領域的基因及其工程菌株，具體是一種灰略紅鏈霉菌的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實現方法。?

背景技術

氮是植物生長發育過程中最重要的營養元素之一。目前，維持或提高作物產量的主要方法是大量施肥，然而氮肥的大量施用，不僅增加了農民的生產成本，而且會加劇水體的富營養化及溫室氣體的排放。?

對作物而言，能夠吸收同化NO₃^－、NH₄⁺及氨態N等不同氮素形態，但是一般以NO₃^－為主要氮源。植物以NO₃^－為氮源時，氮同化可以分為3個階段：(1)氮的無機同化(NO₃^－‐NO₂‐NH₄⁺)；(2)氨的同化，即NH₄⁺經過谷氨酰胺合成酶(GS)合成谷氨酰胺，再由谷氨酰胺經谷氨酸合酶(GOGAT)合成谷氨酸；(3)氨的有機同化，即由谷氨酰胺和谷氨酸合成其它氨基酸，進而合成蛋白質和其他物質。由此可見，谷氨酰胺合成酶在氮同化通路中起著十分關鍵的作用。?

生物體對氮元素的同化是十分重要的生理過程，無機氮必須同化為谷氨酰胺形式的有機氮才能被生物體吸收利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine?synthetase,GS)是氮同化途徑的關鍵酶，它與谷氨酸合成酶共同作用，催化NH₄⁺同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，將其酰胺轉移到α‐酮戊二酸上，從而生成兩分子谷氨酸。谷氨酰胺在生物體含氮有機物的生物合成中作為氮供體，而外界無機氮也必須通過這個途徑才能進入生物體內的氮循環。因此谷氨酰胺合成酶在生物體氮同化過程中起到十分重要的作用。?

土壤中含有十分豐富的細菌群體。細菌谷氨酰胺合成酶涵蓋目前發現的三大類谷氨酰胺合成酶GSⅠ、GSⅡ和GSⅢ，且相比植物谷氨酰胺合成酶基因具有種類多、易克隆等優勢。灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)是一種常見的土壤細菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鑒定對于鑒定氮高效基因并應用于逆境條件下土壤理化性質的改善具有重要意義。?

發明內容

本發明針對現有技術存在的不足，提出一種基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實現方法，通過本發明所述的方法能夠高效表達一種克隆自灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶，可以克服谷氨酰胺合成酶在原始菌株內表達量較低等缺點，有助于解決肥料利用率較低等問題，此外對于實現土壤中銨鹽的快速轉化進而培肥土壤，最終實現精準農業具有重大意義。?

本發明是通過以下技術方案實現的：?

本發明涉及一種谷氨酰胺合成酶的工程菌，該工程菌為外源表達谷氨酰胺合成酶的大腸桿菌。?

所述的胞內谷氨酰胺合成酶具體為灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1谷氨酰胺合成酶大亞基基因SG‐GE，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示；核苷酸序列為1377bp，編碼453個氨基酸。?

所述的谷氨酰胺合成酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。?

所述的灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1，現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC?No.5706，保藏日期為2012年1月9日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101。?

本發明涉及上述工程菌的實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增得到谷氨酰胺合成酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿菌表達載體pET‐22b(+)中得到含有谷氨酰胺合成酶編碼基因的重組表達載體；再將重組表達載體導入大腸桿菌表達菌株，篩選得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。?

所述的含有酶切位點的引物包括：?

GE‐Msc?I‐F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC?

GE‐EcoR?I‐R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC?