[發明專利]基于纖維素代謝通路關鍵酶的工程菌及其實現方法

在審

• 申請號: 201410374224.9
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104178444A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;孫玉靜;支月娥;羅艷青
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19;C12R1/465
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種生物基因工程技術領域的基因及其工程菌株，具體是一種灰略紅鏈霉菌的基于外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶的工程菌及其實現方法。?

背景技術

木質纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產生的主要干物質，主要包括纖維素、半纖維素和木質素。據估計，每年全世界綠色植物光合作用產生的木質纖維素總干重為l730億t，所含總能量高達2×10¹⁸KJ，相當于每年全世界消耗能量的10倍。木質纖維素的生物降解和解聚作用是一個高度復雜的過程，涉及眾多酶系的參與。?

木質纖維素中的纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機溶劑，性質穩定。纖維素降解需要纖維素酶的參與，而纖維素酶并不是一種簡單的酶，是由若干種相互關聯的酶組成的一個復雜的酶系，主要由3類組成：內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶(Endo‐β‐1,4‐glucanase)，稱為Cx酶；外切葡聚糖酶(EXo‐β‐1,4‐glucanase)，稱為C1酶；β‐葡萄糖苷酶(β‐glucosidase)，稱為BG酶或CB酶。目前普遍接受的觀點是3種酶協同作用于纖維素的降解過程，即首先由Cx酶在纖維素聚合物的內部起作用，在纖維素的非結晶部位進行切割，產生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位，從末端進行水解，最后由CB酶將纖維二糖徹底水解為葡萄糖。因此，對于實現纖維素的快速徹底水解上述三種酶是缺一不可的。?

已證實，自然中的細菌、真菌乃至放線菌均具有上述三種纖維素酶的合成能力。與真核生物相比，原核生物具有生長速度較快，且基因無內含子，具有易克隆、易表達等優勢。鏈霉菌作為土壤中常見的一類細菌(放線菌)，對多數高分子化合物具有較強的分解能力并在碳循環中起至關重要的作用。其中灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1經證實具有很強的纖維素分解能力。?

發明內容

本發明針對現有技術中外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶在灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)內多為誘導表達且表達水平很低的缺陷，提出一種基于纖維素代謝通路關鍵酶的工程菌及其實現方法，通過全基因組測序分析，從該鏈霉菌基因組分離到與纖維素降解有關的基因序列，其中包括編碼外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶的基因序列。本發明通過對灰略紅鏈霉菌內相關基因(GC含量70％以?上)進行序列優化后進行全基因合成，并將目的基因序列插入到共表達載體中，最終實現纖維素降解關鍵酶的體外共表達。本發明對灰色鏈霉菌內纖維素降解通路的研究乃至實現纖維素的快速降解均具有重要意義。?

本發明是通過以下技術方案實現的：?

本發明涉及一種纖維素代謝通路關鍵酶的工程菌，該工程菌為通過全基因合成獲得的外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因的重組過表達菌株。?

所述的纖維素代謝通路關鍵酶是指灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶。?

所述的外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EX，如SEQ?ID?No.1所示，內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EN，如SEQ?ID?No.2所示，β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列BG，如SEQ?ID?No.3所示；其中：外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的基因序列為1641bp，編碼546個氨基酸；內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的基因序列為1029bp，編碼342個氨基酸；β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因的基因序列為1359bp，編碼453個氨基酸。?

所述的全基因合成是指：通過對灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因序列進行優化，設定表達宿主為E.coli?K12，回避Nde?I、Nco?I、BamH?I、Xho?I、Msc?I和EcoR?I酶切位點、同時避免序列中出現不依賴rho因子的轉錄終止子及核糖體結合位點。?