[發明專利]環酯肽類抗生素黑莫他丁的高產菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 201410372728.7
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104164399B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 鞠建華;馬俊英;張云;李青連;黃洪波;宋永相;王博;謝運昌
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12R1/465
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發明公開了環酯肽類抗生素黑莫他丁的高產菌株及其構建方法。黑莫他丁的高產菌株是將S.himastatinicus sp.Nov的hmtA基因或者hmtB基因失活，由此獲得himastatin高產突變株S.himastatinicus sp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發明通過失活S.himastatinicus sp.Nov的環脂肽類抗生素himastatin的生物合成基因簇上游的Mer家族轉錄調控基因hmtA和乙酰谷氨酸激酶基因hmtB而分別得到hmtA失活的突變株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB失活的突變株S.himastatinicus sp.Nov Ju2015。突變株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和Ju2015的himastatin的產量是野生型S.himastatinicus sp.Nov的10倍以上。因此，該環脂肽類抗生素himastatin兩個高產突變株的成功構建為加速himastatin產業化進程帶來了可能與希望。

技術領域：

本發明屬于微生物基因工程和代謝工程領域，具體涉及環酯肽類抗生素黑莫他丁(himastatin)的高產菌株及其構建方法。

背景技術：

環肽類化合物是一類以酰胺鍵形成的環狀化合物，主要是由氨基酸、糖肽、脂肽和核苷肽經過一系列修飾后組合而成的復雜分子。該類化合物廣泛存在于無脊椎動物(海綿、海鞘、苔蘚蟲類等)、細菌、藍細菌、真菌和放線菌中，多數具有復雜新穎的結構特征，其最突出的特點是環狀結構以及各種氨基酸衍生物結構單元。環狀結構賦予該類化合物一定的物理剛性以及對蛋白水解作用的耐受性，而不同的衍生結構更使得該類化合物具備各種生理生化特質。因其多數具有出色的生物學性能(抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、免疫抑制活性、抗蟲、抗瘧及生理生化調控作用等)，使得該類化合物已經成為了合成化學、藥物篩選和開發的重點關注對象。其中的一些化合物已經成功用于臨床疾病的治療。例如抗真菌作用短桿菌酪肽A(tyrocidine A)、用于器官移植抗排斥作用的環孢菌素A(cyclosporin A)、對甲氧西林耐藥的金葡菌具有良好活性的萬古霉素(Vancomycin)、對甲氧西林耐藥金葡菌和萬古霉素耐藥腸球菌均具有良好的抗菌活性的達托霉素(daptomycin)等，均是該類化合物用于臨床治療的成功典范。

但是，其中的一些環肽類化合物由于其水溶性較差、副作用較大或化合物的產量低等原因而退出了臨床試驗，但這也間接說明了對這些化合物進行結構改造和優化或提高其產量的必要性和迫切性。而且由于這些化合物多數具有復雜結構、眾多的手性中心及閉環位置的選擇嚴重制約著對這類化合物進行結構改造的效率或產業化的進程。針對傳統的天然產物篩選和研發手段的局限性，在二十世紀九十年代發展出一種以基因工程和酶學研究為基礎的生物合成技術——組合生物合成(combinatorial biosynthesis)，不僅彌補了傳統研究方法的不足，而且為生物醫藥領域的進一步拓展提供了新的研究思路和研究方向。而且隨著基因組測序技術和基因重組技術等的飛速發展，組合生物合成已給生物學領域帶來了革命性的變化，同時也給化學學科創造新的化學結構和構建化合物庫帶來了新的方法和提供了有益的補充。此外，抗生素的生物合成基因通常在染色體或巨型質粒的一段連續區域成簇排列的特征，(包括結構基因、自我抵抗基因、轉運基因和調控基因)為進一步開發和改造抗生素提供了新的契機。截至2006年，已有近300種微生物次級代謝產物的生物合成基因簇得到克隆和功能鑒定，為利用組合生物合成技術、代謝工程技術和體外酶學技術來創造或改造以得到新的化合物奠定了基礎。已經有諸多研究通過生物合成和組合生物合成技術成功完成了較多結構復雜的天然產物的結構修飾、改造或某些目標成分的定向積累，構建了一系列活性相當或活性較強的衍生物，或高產突變株，為鏈霉菌的基因工程改造提供了有益的方法學的借鑒樣本，為解決日益棘手的病原微生物的耐藥問題和腫瘤疾病的治療帶來了新希望。

環脂肽類抗生素黑莫他丁(himastatin)，其結構如圖1所示，體外活性分析顯示其對革蘭氏陽性菌有較好的抑菌活性，對P388細胞系和褪黑色素瘤B16細胞系有顯著的細胞毒活性。