[發明專利]硼替佐米對K562細胞株中DNA甲基轉移酶表達的檢測方法

無效

• 申請號: 201410371771.1
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104142405A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 吳圣豪;鄭翠蘋;陳松燕;蔡小平;石岳堅
• 申請（專利權）人: 溫州市中心醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 溫州甌越專利代理有限公司 33211
• 代理人: 陳加利

1.一種硼替佐米對K562細胞株中DNA甲基轉移酶表達的檢測方法，其特征在于：

（1）設置對照組與實驗組：將K562細胞置于含10％滅活新鮮小牛血清RPMI-1640?培養液，在37?℃，體積分數為5％CO₂、飽和濕度條件下培養，保持細胞活力＞?97％，取指數生長期的K562細胞（1×10⁵/ml）分為對照組與實驗組，實驗組分別加入6nmol/L、20nmol/L和60?nmol/L的硼替佐米，分別作用時間分別為12?h、24?h和36?h；對照組加入無硼替佐米的細胞培養液，相同條件下培養；

本步驟獲得以下實驗組和對照組：

A?組，不加任何處理的對照組；B?組，6?nmol/L?硼替佐米處理組；C?組，20?nmol/L?硼替佐米處理組；D?組，60nmol/L?硼替佐米處理組；

（2）蛋白印跡法檢測胞內DNMT1?表達：收集硼替佐米作用12?h?后的各處理組細胞，Western?及IP細胞裂解液提取胞內蛋白，參照試劑盒說明用BCA方法測定蛋白濃度，并調節濃度，每泳道取100?μg上樣，于10％十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，電轉至硝酸纖維膜，以β-actin?為內參蛋白，加入兔抗人DNMT1?多克隆抗體、β-actin?一抗，堿性磷酸酶標記山羊抗兔二抗，BCIP/NBT?堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色，采用BandScan?軟件分析各組蛋白條帶與相應β-actin?的A?值之比；實驗重復3?次；

（3）Annexin-V?法流式細胞儀（FCM）檢測K562細胞凋亡率：收集硼替佐米各濃度處理12-36?h?的K562?細胞1×106?個，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，?離心棄上清，加入100?μl?Binding?Buffer?和FITC?標記的Annexin-V?（20?mg/L）10?μl，室溫避光30?min，再加入PI（50?mg/L）5?μl，避光反應5?min后，加入400?μl?Binding?Buffer，立即用FCM?進行定量檢測，同時以不加AnnexinV-FITC?及PI?的一管作為陰性對照，單純FITC?陽性（FITC＋/PI-）細胞群為早期凋亡細胞。