[發(fā)明專利]一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法及其專用試劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410371645.6
• 申請(qǐng)日: 2014-07-31
• 公開（公告）號(hào): CN104130970B
• 公開（公告）日: 2016-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐德林;錢剛;張林;楊璐萍;儲(chǔ)士潤;沈訪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04
• 代理公司: 遵義市遵科專利事務(wù)所 52102
• 代理人: 劉學(xué)詩

1.一種制備紫花白及原生質(zhì)體的方法，其特征是，該方法包括如下步驟：原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測(cè)定、原生質(zhì)體活力率的測(cè)定；

（1）原生質(zhì)體的分離：選取紫花白及組培再生苗或野生植株大而飽滿的葉片，在超凈工作臺(tái)中將其橫向切割為1mm的片段，放入60mm培養(yǎng)皿中，將酶溶液A倒入培養(yǎng)皿里，用鑷子將所取材料浸泡入酶溶液A中，pH值為5.7，根據(jù)材料的多少來決定酶溶液A的使用量，酶溶液A與材料比例為10ml:1g，然后用封口膠封口，置于恒溫?fù)u床上黑暗處理4?h，震蕩條件為26-28℃、120rpm，即終止酶解，此時(shí)原生質(zhì)體已充分分離出來，用吸頭輕輕吹打葉片，以釋放出全部原生質(zhì)體，獲得原生質(zhì)體酶溶液；

（2）原生質(zhì)體的純化：將原生質(zhì)體酶溶液用200目的細(xì)胞篩過濾，再將濾液置于2ml離心管中，在100g/min下離心3min，使原生質(zhì)體沉降，然后棄上清夜，將沉降物緩慢加入酶溶液B中，在100?g/min的轉(zhuǎn)速下離心3-5次，每次3min，最終得到純化的原生質(zhì)體；

（3）原生質(zhì)體產(chǎn)量的測(cè)定：將純化的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入2ml酶溶液B中，輕輕吹打，使原生質(zhì)體分布均勻，用移液槍吸取一滴在血球計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)三次，取平均值；根據(jù)加入酶溶液A中葉片的多少計(jì)算出每克葉片得到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量，計(jì)算結(jié)果以每克葉片原生質(zhì)體數(shù)表示（個(gè)/g）；

（4）原生質(zhì)體活力率的測(cè)定：利用FDA（熒光素雙醋酸酯）透過原生質(zhì)體后，在酯酶的作用下迅速分解，放出熒光素，使有活力的原生質(zhì)體發(fā)出黃綠色的熒光從而來鑒定原生質(zhì)體的活力；計(jì)算原生質(zhì)體活力時(shí)需在明視野下觀察原生質(zhì)體總數(shù)，然后再轉(zhuǎn)到熒光下記錄有活力的原生質(zhì)體數(shù)，最后計(jì)算原生質(zhì)體活力率。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備紫花白及原生質(zhì)體的方法，其特征是：所述培養(yǎng)皿為直徑60?mm、高15?mm的玻璃培養(yǎng)皿。

3.一種用于權(quán)利要求1所述的制備紫花白及原生質(zhì)體的方法的專用試劑，包括酶溶液A和酶溶液B；

所述酶溶液A配比如下：

成分加入量

MES???????????????????????1.0ml（200?mmol）

KCl???????????????????????2.5ml（80?mmol）???

Mannitol?5.0ml（0.8?mol）

Cellulase?R10?150.0mg

Pectolyase?Y-23??50.0mg

BSA???1.0ml（10?mg）

CaCl₂?400.0ul（250?mmol）

ddH₂O?100.0ul

所述酶溶液A中成分濃度為：Mannitol?0.16?mol/ml，MES?0.2?mol/ml，KCl?0.032?mol/ml，CaCl_2?0.625?mol/ml；

所述酶溶液B配比如下：

成分??加入量

MES???1.0ml（200?mmol）

KCl???2.5ml（80?mmol）

Mannitol?5.0ml（0.8?mol）

BSA???1.0ml（10?mg）

CaCl₂?400.0ul（250?mmol）

ddH₂O?100.0ul

所述酶溶液B中成分濃度為：Mannitol?0.16?mol/ml，MES?0.2?mol/ml，KCl?0.032?mol/ml，CaCl_2?0.625?mol/ml。