[發明專利]大麗輪枝菌致病相關基因VdNUC-2的功能分析及其應用

無效

• 申請號: 201410369671.5
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104140973A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 鄧晟;林玲;王彩月;張昕
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/80;C12Q1/68;C12R1/645
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及大麗輪枝菌(Verticillium?dahliae)致病相關基因VdNUC-2的功能分析及其潛在應用的研究，屬于生物技術研究領域。

背景技術

無機磷酸鹽(inorganic?phosphate)是生物細胞中不可缺少的重要營養物質之一，在其被吸收后，將以磷酸化合物的形式參與生物細胞的多種關鍵的生理生化過程。這些過程包括遺傳物質脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic?acid，DNA)和核糖核酸(ribonucleic?acid，RNA)的合成，細胞膜結構上磷脂類物質的合成，蛋白質的磷酸化以及一切以三磷酸腺苷(Adenosine?triphosphate，ATP)為底物的需要能量轉換而完成的生化和細胞生物學反應。因此，調節和維持細胞內磷酸鹽水平的穩定對于生物細胞來說顯得尤為重要。

在各類真菌中，感應磷酸鹽胞外濃度以及調控磷酸鹽吸收的分子機理以模式菌株Saccharomyces?cerevisiae(釀酒酵母)和Neurospora?crassa(粗糙脈孢霉)解析的最為透徹和深入。目前研究發現，在N.crassa中控制磷酸鹽吸收的有四個基因，NUC-2，PREG，GPOV和NUC-1；而在S.cerevisiae中，有四個基因在功能上分別與之相對應，它們是PHO81，PHO80，PHO85和PHO4。PHO80是一種細胞周期蛋白，而PHO85則是細胞周期依賴的蛋白激酶。PHO85和PHO80形成復合物，通過對PHO4的超磷酸化負調控磷酸鹽吸收系統(Kaffman?et?al.，1994)。PHO4是一個轉錄因子，當其抑制因子被解除后，可以激活下游參與磷酸鹽吸收的各個基因的轉錄表達(Kang?and?Metzenberg，1990)。1990年，PHO81基因在酵母中被克隆；1996年，Peleg等人在N.crassa中克隆并鑒定了其同源基因NUC-2。在磷酸鹽感應和吸收信號途徑中，NUC-2被認為是在所有四個基因的最上游(Gras?et?al，2013)。當外界磷酸鹽水平降低時，NUC-2通過一系列的信號作用抑制PREG-GPOV復合物(功能與PHO85-PHO80復合物相似)的活性，從而使NUC-1(功能與PHO4相似)的功能被啟動，激活下游的參與磷酸鹽吸收的功能基因的轉錄。

目前由大麗輪枝菌引起的多種經濟、園藝作物的黃萎病在生產上仍為害較重，而且由于抗性品種缺乏，加之病菌定殖于作物根部和維管束系統，導致常規的防治方法很難有效控制病害。而越來越多的大麗輪枝菌致病相關基因和效應因子的發現為該病害的防治提供了潛在的、新的藥物作用靶標和定向作物分子育種的技術、理論儲備。

對于一部分細菌和真菌，在構建載體時，將其基因組上靶標基因兩側一定長度的同源序列進行克隆，并且將抗生素抗性基因盒連接到兩者當中。利用如原生質體轉化或農桿菌介導的轉化方法，將這一帶有同源序列的質粒導入該微生物細胞內后，細胞會在一定比例上啟動核酸修復機制，而原靶標基因的核酸序列將被載體上帶有抗性基因盒的序列替換，從而產生不含有靶基因的敲除突變體。而通過對敲除突變體表型的觀察和檢測，可以確定該基因的生物學功能及其在相關領域的應用前景。

發明內容

從大麗輪枝菌V07DF2菌株中克隆了參與磷酸鹽吸收途徑的VdNUC-2基因，該基因全長為6542個堿基(包括該基因的啟動子、外顯子、內含子和終止子，詳見序列1)。根據該基因及其側翼的核酸序列，構建了針對該基因的敲除、回補載體。利用農桿菌介導的轉化方法，獲得了該基因的敲除突變體和回補突變體。通過對這些轉基因材料的表型觀察和分析，發現VdNUC-2基因不僅控制病原菌對磷酸鹽的感應和吸收，同時還影響病原菌對棉花的致病能力。另外，序列分析表明，VdNUC-2表達的蛋白質在植物和動物當中沒有同源物，因此，以VdNUC-2蛋白作為殺菌劑的潛在作用靶標對于作物、動物和人都是安全、無風險的。

相關技術路線如下：

1.利用網上共享的生物信息資源，設計核酸引物，構建VdNUC-2基因的敲除載體，并將載體導入大腸桿菌和農桿菌菌株中。

2.利用網上共享的生物信息資源，設計核酸引物，構建VdNUC-2回補載體，并將載體導入大腸桿菌和農桿菌菌株中。