[發(fā)明專利]一種用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410369525.2
• 申請日: 2014-07-30
• 公開（公告）號: CN104164499A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙越;王佰潔;魏自民;趙昕宇;張旭;魏雨泉;王雪芹
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 宋焰琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物，可用于對樣品中嗜冷桿菌的分子檢測。

背景技術(shù)

嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)細(xì)菌，分類于莫拉氏菌科(Moraxellaceae),包括靜止嗜冷桿菌(P.immobilis)、糞嗜冷桿菌(P.faecalis)、居冷嗜冷桿菌(P.frigidicola)、冷棲嗜冷桿菌(P.glacincola)等共9種細(xì)菌。該屬的菌株為革蘭氏陰性需養(yǎng)桿菌或球菌，其大小為(0.9-1.3)um×(1.5-3.8)um無動力，需氧，能夠在5℃下生長，一般在35-37℃范圍內(nèi)不能生長，氧化酶和接觸酶均為陽性，因在低溫下生長良好而得名。主要分布于常冷的環(huán)境如南北兩極地區(qū)、高山、冰川、冷庫、深海和土壤等低溫環(huán)境中，它能通過特殊的生理機制適應(yīng)環(huán)境溫度的變化，在對污水中油烴類，氯酚類等物質(zhì)的生物降解、催化低溫發(fā)酵、表達(dá)熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)以及生產(chǎn)抗凍保護劑等方面有著廣泛的應(yīng)用。

嗜冷桿菌的分離主要是依賴選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的經(jīng)典生物學(xué)方法，然后通過細(xì)菌生理生化特性進(jìn)行分類鑒定。但該法分離周期長，工作量大且不易獲得目的功能菌株和純菌株，這使得嗜冷桿菌的發(fā)現(xiàn)和分離具有偶然性和隨機性，大大降低了挖掘這一特定種屬菌株資源的幾率。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，基于PCR的分子檢測技術(shù)已在環(huán)境微生物研究中應(yīng)用越來越普遍。通過對菌株進(jìn)行DNA提取，使用細(xì)菌16srDNA通用引物27F/1492R擴增目的片段，測序可得知其基因序列，但該法的特異性不強，特別是多種菌共存的混合DNA樣品，尚無法用現(xiàn)有的引物對從混合DNA樣品中直接擴增出具有嗜冷桿菌(Psychrobacter)遺傳特性的16srDNA?V3可變區(qū)域部分序列，給土壤中嗜冷桿菌的檢測研究帶來了困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于擴增嗜冷桿菌的特異性引物，以改進(jìn)公知技術(shù)中存在的缺陷。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的用于擴增嗜冷桿菌屬的特異性引物為：5′-AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3′。

所述的特異性引物中，5′-AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3′為正向引物；5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為反向引物。

本發(fā)明的用于擴增嗜冷桿菌的特異性引物可以解決目前缺乏引物從混合DNA樣品中直接擴增出具有嗜冷桿菌(Psychrobacter)遺傳特性的16srDNA?V3可變區(qū)域部分序列的問題。

附圖說明

圖1為實施例1中PsyF/1492R引物對6種屬細(xì)菌DNA擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。

圖2為實施例2中PsyF/1492R引物對土壤樣品DNA擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。

具體實施方式

本發(fā)明以特異性引物5′-AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3′(命名為PsyF)作為正向引物，與5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(通用引物中的1492R)為反向引物配對使用，即可從各類樣品DNA中直接擴增出長度大約為1078bp的嗜冷桿菌目的片段。

以下結(jié)合實施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的技術(shù)方案不局限于以下所列舉的實施例，還包括個具體實施例間的任意組合。

實施例一

分別以嗜冷桿菌(Psychrobacter)，黃桿菌(Flavobacterium)，腸桿菌(Enterobacter)，節(jié)桿菌(Arthrobacter)，芽孢桿菌(Bacillus)和假單胞菌(Pseudomoans)6個屬細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行引物PsyF/1492R的特異性驗證試驗。

PCR擴增體系為：25μL由0.5μL?DNA模板(約10ng)、2.5μL正向引物PsyF(10pM)、2.5μL反向引物1492R(10pM)、2.5μL?10×PCR?buffer(含Mg2+)、2.0μL?dNTP?s(2.5mmol/L)、0.1μL?Taq?DNA聚合酶(5U/μL)，滅菌雙蒸水補足25μL。PCR擴增反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，5min，變性94℃1min，退火50℃50s，延伸72℃1min，共30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。