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[發(fā)明專利]利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因表達譜的方法有效

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201410369360.9 申請日: 2014-07-30
公開(公告)號: CN104087681A 公開(公告)日: 2014-10-08
發(fā)明(設計)人: 董虹;張濤;姜代勛;胡格;段慧琴;穆祥;陳武 申請(專利權(quán))人: 北京農(nóng)學院
主分類號: C12Q1/68 分類號: C12Q1/68
代理公司: 北京和信華成知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11390 代理人: 胡劍輝
地址: 102200 北*** 國省代碼: 北京;11
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摘要:
搜索關鍵詞: 利用 基因芯片 檢測 小檗堿 誘導 rmmvecs 基因 表達 方法
【說明書】:

技術(shù)領域

發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領域,尤其是涉及一種利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因表達譜的方法。

背景技術(shù)

基因芯片(gene?chip)又稱為DNA陣列,為生物芯片的一種,是指將大量DNA或寡核苷酸探針密集排列形成的探針陣列?;蛐酒募夹g(shù)原理是DNA的堿基配對和互補,基礎是雜交測序(SBH)?;蛐酒捎霉鈱г缓铣苫蛭⒘奎c樣的方法,將寡核苷酸或cDNA有序地固化于支持物的表面,與已標記的待測生物樣品的cDNA或cRNA雜交,通過激光共聚焦掃描等特殊設備對雜交信號的強度進行檢測分析,從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。從二十世紀八十年代初SBH概念的提出,到目前的商品化基因芯片在這十幾年時間里,芯片的制作技術(shù)不斷完善、芯片的概念不斷延伸、芯片的應用范圍不斷拓展,使得生物芯片技術(shù)對二十一世紀生命科學和醫(yī)學的發(fā)展產(chǎn)生無法估量的影響。芯片所帶來的巨大學術(shù)價值、社會價值和經(jīng)濟價值引起了多家大公司及多國政府機構(gòu)的極大興趣,并投以可觀的財力,這又使芯片技術(shù)得以迅速發(fā)展。

目前基因芯片按功能可以分為表達譜基因芯片和DNA測序芯片兩大類;按探針的長短可分為長探針芯片和短探針芯片。

基因芯片是后基因組時代一項重要技術(shù),它的出現(xiàn)為中醫(yī)藥學的現(xiàn)代化提供了一個很好的切入點,其特點是可以在同一時刻對成千上萬個基因的表達情況進行分析,形成完整的細胞基因表達譜,解決了傳統(tǒng)中藥藥理研究方法周期長、耗時多、產(chǎn)出少的問題。微血管內(nèi)皮細胞能夠通過其分泌功能發(fā)揮信息的傳導和調(diào)節(jié)功能,保證血液與組織液之間、血液與淋巴液之間以及血液本身的有形成分與血漿之間復雜的生理、生化以及血流動力學的內(nèi)環(huán)境平衡,同時分泌多種細胞因子和局部激素,參與一系列生理和病理過程。但是在現(xiàn)今的微血管內(nèi)皮細胞的相關研究領域中,基因芯片技術(shù)的應用還不是很普遍。張斌等應用基因芯片技術(shù)分別檢測正常濃度和高濃度D-葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)后內(nèi)皮細胞的基因表達譜。結(jié)果表明高糖可能通過影響微血管內(nèi)皮物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導、細胞膜結(jié)構(gòu)和細胞外基質(zhì)等的表達而導致血管內(nèi)皮功能紊亂,為進一步研究高糖對微血管內(nèi)皮細胞基因表達譜的影響提供資料。YμE?Fei等采用基因芯片技術(shù)研究了堿性成纖維細胞生長因子(basic?fibroblast?growth?factor,bFGF)對小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(microvascμlar?endothelial?cell,MVEC)株bEnd.3中血管新生相關基因表達譜的改變,結(jié)果提示:bFGF具有上調(diào)促血管新生基因表達,下調(diào)抑制血管新生基因表達的作用,兩者協(xié)同作用,促進血管新生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的一個技術(shù)問題就是通過對小檗堿誘導體外培養(yǎng)的RMMVECs產(chǎn)生的差異性基因表達譜的分析,來探討提高微血管舒縮活動振幅的分子機制,從基因表達水平充分驗證了,提高微血管舒縮活動振幅的中藥有效成分Ber能雙向調(diào)節(jié)RMMVECs相關細胞因子的表達,維持細胞因子分泌的平衡,維持MVECs的正常生理功能,從而阻斷了致病因子對微血管內(nèi)皮細胞的傷害,發(fā)揮治療疾病的作用。

為了解決上述問題,本發(fā)明提供一種利用基因芯片檢測小檗堿誘導RMMVECs基因表達譜的方法,包括以下步驟:

(1)制備并純化大鼠心肌膜微血管內(nèi)皮細胞RMMVECs;

(2)培養(yǎng)二代RMMVECs,將小檗堿溶解于維持培養(yǎng)基中,濃度為10μg/ml,在37℃、5%CO2的條件下,將RMMVECs繼續(xù)培養(yǎng)9h;

(3)將RMMVECs充分裂解,提取總RNA;

(4)純化、定量總RNA;

(5)反轉(zhuǎn)錄合成First-strand?cDNA;

(6)合成Second-strand?cDNA;

(7)體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA;

(8)cRNA反轉(zhuǎn)錄;

(9)熒光標記后進行基因芯片雜交,最后進行數(shù)據(jù)分析。

所述方法,步驟(1)中采用差速貼壁法對所制備的RMMVECs進行純化。

所述方法,步驟(3)中充分裂解的方法為:將RMMVECs用37℃預熱的PBS清洗3遍,加入2ml?Trizol溶液,靜置5min,用移液槍吹打,使RMMVECs充分裂解,轉(zhuǎn)入離心管,于-80℃冰箱保存待用;

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