[發明專利]Mb1961c蛋白的新用途

有效

• 申請號: 201410368059.6
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104163859A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 焦新安;陳祥;孟闖;萬婷;徐正中;殷月蘭;潘志明;耿士忠;黃金林;李求春;孫林
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;G01N33/531
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 郭婧婧

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種牛分枝桿菌Mb1961c蛋白的新用途。

背景技術

牛結核病主要由牛型分枝桿菌感染牛引起的一種慢性細菌性疾病，也可感染人類和其他一些動物引起相應疾病，被國際動物衛生組織(OIE)列為需通報的動物疫病。牛結核病直接影響牛的生產力及產品的國際貿易，造成巨大經濟損失，同時其作為一種重要的人獸共患病，也是公共衛生的重大威脅。雖然大部分發達國家由于采取“檢疫-撲殺”的根除策略和強大的經濟支撐，牛結核病的流行率已降至很低水平，但至今尚無任何國家獲得OIE“無結核”認可。另外，牛結核病在許多發展中國家仍十分流行，近年來隨著養牛業突飛猛進的發展，我國一些地區的發病率也呈上升趨勢。因此，如何有效預防和檢測牛結核具有重要的經濟和社會意義。

鑒于分枝桿菌感染初期機體的免疫應答主要以細胞免疫為主，故牛結核病的檢疫主要通過細胞免疫應答為基礎的檢測手段，包括結核菌素皮內變態試驗(TST)和牛結核外周血γ-干擾素體外釋放試驗(簡稱IFN-γ法)。其中TST是OIE指定也是應用最普遍的牛結核病檢測方法，但其敏感性和特異性受限。IFN-γ法主要檢測特異性抗原體外刺激全血后產生的IFN-γ水平，已被OIE認可。這兩種方法均使用到結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)，PPD由分枝桿菌培養物滅活提純得到，成分復雜，其特異性易受交叉反應影響，經常造成診斷結果的假陽性，給生產帶來一些不必要的損失。因此，探索特異、敏感的檢測抗原對控制牛結核有重要意義。

Mb1961c蛋白是牛分枝桿菌一種主要分泌蛋白，是由毒力相關基因Mb1961c編碼的低分子量蛋白質，為牛分枝桿菌靜息期分泌的主要膜蛋白。該蛋白分子量為16kDa，其基因共編碼159個氨基酸，其中前29個氨基酸為信號肽，130個為成熟蛋白。該蛋白存在于結核分枝桿菌復合群中，且高度保守，在環境分枝桿菌等非致病菌中則不存在該抗原的基因。

目前，尚未有研究將Mb1961c蛋白作為外周血γ-干擾素體外釋放試驗的刺激劑，用于牛結核病的診斷。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，針對牛型PPD存在的非特異性及PPD制備繁瑣等不足，提供一種高特異性和高敏感性的PPD替代的重組蛋白牛分枝桿菌Mb1961c蛋白，作為牛結核病外周血γ-干擾素體外釋放試驗的刺激劑，提高檢測結果的靈敏度和特異性。

本發明的第一方面公開了一種外周血γ-干擾素體外釋放試驗刺激劑，所述刺激劑含有Mb1961c蛋白。

本發明的第二方面公開了Mb1961c蛋白在制備牛結核外周血γ-干擾素體外釋放試驗的刺激劑中的新用途。

進一步的，所述Mb1961c蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

進一步的，所述Mb1961c蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

本發明的第三方面公開了Mb1961c蛋白的制備方法。所述Mb1961c蛋白可利用常規的基因工程的制備方法獲得。例如：通過PCR擴增相應的編碼基因序列，經克隆篩選和測序鑒定正確后，利用pET30a質粒構建原核表達載體，將鑒定正確的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選獲得陽性轉化子，再以IPTG誘導表達，對以胞內可溶性表達的Mb1961c蛋白進行親和層析純化，即得。

進一步的，所述制備方法為：提取牛分枝桿菌基因組DNA作為模板，PCR擴增Mb1961c基因片段，將Mb1961c片段插入pCR2.1載體轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆；酶切、回收和連接Mb1961c與pET30a(+)片段，構建重組質粒pET-Mb1961c，轉化大腸桿菌BL21(DE3)；IPTG誘導表達，超聲裂解，上清經NI-NTA柱純化；收集洗脫液于PBS中透析24h，進行濃度和純度定量，即得。

本發明的有益效果為：