[發明專利]斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201410367585.0
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104099340A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 趙超;邱麗華;江世貴;周發林;傅明駿
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 黃為

1.一種斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.制備權利要求1所述的斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列的方法，其特征在于，依次包括下述方法：

1)總RNA的提取

對斑節對蝦解剖并取出性腺混合液，將性腺混合液于Trizol中勻漿，提取斑節對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存；

2)cDNA第一鏈的合成

將步驟1)中的斑節對蝦性腺總RNA與反轉錄引物混合，在反轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈；

3)斑節對蝦細胞周期蛋白E基因的PCR擴增、克隆

以步驟1)中合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增法對目的基因的5ˊ和3ˊ末端進行PCR擴增；

其中：

在3ˊRACE中，利用降落PCR方法，用接頭引物和cycE-F1、cycE-F2進行PCR擴增；

在5ˊRACE中，首先利用末端轉移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的cDNA為模板，以cycE-R1和oligo-dG為引物進行一次PCR，所得PCR產物取用cycE-R2和oligo-dG進行二次PCR擴增；

4)對斑節對蝦細胞周期蛋白E基因的測定

所得到的PCR產物在分離檢測后，再將PCR產物純化，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，測序；

5)斑節對蝦細胞周期蛋白E的分布和表達

a)提取斑節對蝦不同組織的RNA，按照PremeScriptTM?RT?reagent?Kit操作手冊進行反轉錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA稀釋作為模板，采用SYBR?Green?Ⅰ染料法，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析；

b)依照TaKaRaPrimeScriptTM?RTPCR?Kit試劑盒說明書進行PCR反應，再采用相對ΔCT法分析Pmcyclin?E基因在各樣品中的相對表達量；

c)分別提取實驗室保存的經過MIH處理及眼柄切除手術的卵巢RNA，然后按照上述a)所示方法進行反轉錄及熒光定量。

3.根據權利要求2所述的斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的反轉錄引物的序列為：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3。

4.根據權利要求2所述的斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的反轉錄酶為M-MLV。

5.根據權利要求2所述的斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的反應條件：42℃60min，70℃15min。

6.根據權利要求2所述的斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟3)所述的cycE-F1：5>ACGCCAACCTGACTACCT<3；

cycE-F2：5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3；

cycE-R1：5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3；

cycE-R2：5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC<3。

7.根據權利要求2所述的斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟3)所述的3ˊRACE中反應條件：94℃，5min；94℃，45s；60℃，30s；72℃，45s；35cycles；72℃，10min。

8.根據權利要求2所述的斑節對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟3)所述的在5ˊRACE中反應條件：94℃，5min；94℃，45s；61℃，30s；72℃，45s；35cycles；72℃，10min。